響應面法提取榆干離褶傘多糖的工藝研究

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(鞍山師范學院 化學與生命科學學院，遼寧 鞍山 114007)

蘑菇是自然界中種類繁多、世界分布的生物資源，我國有蘑菇1萬余種，同時也是世界上較早應用蘑菇的國家，《神農本草經》和《本草綱目》中記載了蘑菇的藥用價值[1]。蘑菇中含有多糖類﹑甾體類、萜類、黃酮類等生物活性物質，藥理實驗表明，蘑菇多糖具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫、降血脂、抗肝炎等廣泛的生物活性，已成為藥品和食品行業的開發研究方向[2-4]。榆干離褶傘(Lyophyllum ulmarium)屬白蘑科離褶傘屬，又名對子蘑、大榆蘑，是一種菌肉肥厚，香味濃郁的食用菌，在我國主要分布在東北三省，并已人工馴化栽培成功，研究者發現，榆干離褶傘發酵液和菌絲體具有抗氧化、保肝、溶栓作用和保護血管內皮細胞等功效[5-7]，而子實體生物活性方面的研究鮮見報道。因此，本文采用超聲提取榆干離褶傘中多糖，利用響應面法優化提取條件，旨在為榆干離褶傘開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榆干離褶傘：2015年購買于吉林安圖，由鞍山師范學院化學與生命科學學院張福維教授鑒定為榆干離褶傘(Lyophyllum ulmarium)。

葡萄糖標準品、石油醚、無水乙醇、苯酚、硫酸等試劑均為分析純：國藥集團。

1.2 儀器與設備

Cary50紫外可見分光光度計：美國Varian公司；KQ-700GVDV型三頻恒溫數控超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司；離心機：上海安亭科學儀器廠；電子天平：梅特勒-托利多(上海)有限公司；其他為實驗室常用儀器設備。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的處理

榆干離褶傘經過洗凈，自然干燥，粉碎，備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

參照文獻[8]中的苯酚-硫酸法。

1.3.3 榆干離褶傘多糖的提取及測定

參照文獻[9]中的提取與測定法。

1.3.4 單因素試驗

準確稱取一定量的榆干離褶傘樣品超聲提取。采用不同的超聲時間、超聲功率、超聲溫度、料液比進行提取試驗，考察各因素對提取產率的影響。

1.3.5 響應面優化試驗

在1.3.4試驗基礎上，采用四因素三水平的響應面試驗方法優化提取工藝，試驗數據采用Design Expert 8.0.6軟件分析，得到榆干離褶傘多糖提取的最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 超聲時間對榆干離褶傘多糖得率的影響

在料液比超聲功率440 W、1∶20 (g/mL)、超聲溫度40 ℃條件下，分別經超聲提取15、20、25、30、35min后，分析超聲時間對榆干離褶傘多糖得率的影響，如圖1所示。

圖1 超聲時間對多糖得率的影響

由圖1可知，榆干離褶傘多糖得率隨超聲時間的增加，先升高后下降，在30min時最大。原因在于超聲時間增加會使體系的溫度升高，引起多糖分解[10]，同時考慮超聲時間短，也不利于多糖從組織細胞中溶出，因此選取超聲時間為25～35min。

2.2 超聲功率對榆干離褶傘多糖得率的影響

在超聲時間25min、超聲溫度40 ℃、料液比1∶20 (g/mL)條件下，分別經超聲功率380、410、440、470、500 W后，分析超聲功率對榆干離褶傘多糖得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 超聲功率對多糖得率的影響

從圖2可以看出，隨著超聲功率的增大，多糖得率呈先上升后下降趨勢，原因在于超聲功率的增加會破壞多糖結構，從而降低多糖得率[11-12]。因此超聲功率選擇在380～440 W。

2.3 超聲溫度對榆干離褶傘多糖得率的影響

在超聲功率440 W、料液比1∶20 (g/mL)、超聲時間25min條件下，分別在溫度20、30、40、50、60 ℃提取后，分析超聲溫度對榆干離褶傘多糖得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 超聲溫度對多糖得率的影響

從圖3可看出，多糖提取率隨著超聲溫度的升高先增加后下降趨勢，在50 ℃為最大，原因在于超聲溫度過高也會破壞多糖的結構[13]。因此超聲溫度選擇在40～60 ℃。

2.4 料液比榆干離褶傘多糖得率的影響

在超聲時間25min、超聲功率440 W、超聲溫度40 ℃條件下，分別以料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30提取后，分析料液比對榆干離褶傘多糖得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 料液比對多糖得率的影響

從圖4可看出，隨著溶劑用量的逐漸增大，多糖得率先升高，在1∶20后再下降，原因是提取溶劑的增加，有利于多糖的溶出，但溶劑量過多會降低熱量密度，從而提取率下降[14]，因此料液比選擇在1∶15～1∶25。

2.5 榆干離褶傘多糖提取工藝的響應面優化

2.5.1 回歸模型的建立

在單因素試驗結果基礎上，選取超聲時間、超聲功率、超聲溫度、料液比4個因素進行響應面分析，試驗結果見表1。

表1 試驗設計方案與結果

表1(續)

對表1試驗結果進行Design-Expert 8.0.6.1軟件分析和多元回歸擬合，得榆干離褶傘多糖得率對超聲時間(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)和料液比(D)的二次多項式回歸模型：

Y=7.78-0.30A+0.032B+0.13C-0.46D-0.082AB+0.16AC-0.36AD+0.055BC-0.083BD-0.22CD-0.22A2-0.39B2-0.054C2-0.77D2

方差分析和系數顯著性檢驗結果見表2。

表2 方差分析及回歸系數的顯著性檢驗

注： *代表差異顯著(P<0.05)；**代表差異極顯著(P<0.01)。

由分析發現一次項A、C、D和二次項A2、B2、D2及交互項AC、AD、CD對多糖得率的影響極顯著。同時，表2中模型P<0.0001，極顯著，失擬項(P =0.1442>0.05)不顯著，說明模型是合理的[15]，由此可見，此種試驗方法是可靠的。

2.5.2 響應面交互作用分析與最佳提取條件的確定

方差分析中AB、BC、BD交互作用不顯著(P > 0.05)，因此只對AC、AD和CD的交互作用進行回歸分析，根據回歸方程得出相應的響應面圖，如圖5所示。

圖5 不同因素交互作用對多糖得率影響的響應面圖

響應面坡度越陡越顯著，說明此因素對榆干離褶傘多糖得率的影響越大，反之則表明影響越小；圓形的等高線表示參數之間交互作用不顯著，橢圓形的等高線則相反[16]。由圖5可知，兩因素交互作用大小為∶ 超聲時間和料液比>超聲溫度和料液比>超聲時間和超聲溫度，與方差分析的結果相吻合。

通過響應面回歸分析得出榆干離褶傘多糖最佳提取工藝條件的參數為：超聲時間30.21min、超聲溫度60 ℃、料液比1 ∶17.70、超聲功率414.73 W，多糖得率預測值為8.0117%；結合實際條件，選取超聲時間30min、超聲溫度60 ℃、料液比1∶18、超聲功率415 W，進行三組重復性實驗，多糖得率為7.96%±0.03%，與預測值相近，說明優化模型是可靠的。

3 結論

本研究在單因素超聲提取試驗的基礎上，采用響應面軟件優化榆干離褶傘多糖的最佳提取工藝為：超聲時間30min、超聲溫度60 ℃、料液比1∶18、超聲功率415 W，多糖得率為7.96%±0.03%，該模型回歸顯著，對試驗擬合程度好，有關榆干離褶傘多糖的活性還有待進一步研究。