寵物犬布魯氏菌的分離與16S rDNA序列鑒定

黃 萃，劉林峰，張祥華，鄧賢才，鄔向東*

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寵物犬布魯氏菌的分離與16S rDNA序列鑒定

黃 萃1，劉林峰2，張祥華2，鄧賢才2，鄔向東1*

（1. 江西農業大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045；2. 栢特佳寵獸醫院，江西 南昌 330013）

從某疑似感染布魯氏菌寵物犬全血中分離到一株細菌，對其進行純化培養、染色鏡檢，PCR擴增其16S rDNA基因片段，將擴增的產物純化后測序，用NCBI軟件對測序結果進行同源性檢索，結果顯示其與布魯氏菌同源性達到100%；應用DNAStar軟件進行16S rDNA序列相似性分析，結果分離菌株與布魯氏菌16S rDNA核苷酸序列相似性達99.6%～100%，表明分離菌株為布魯氏菌。其分離菌株是犬種還是牛、羊種布魯氏菌還需要進一步研究。

寵物犬；布魯氏菌；16S rDNA

布魯氏菌病(簡稱“布病”)是由布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病，是一種嚴重的慢性變態反應性傳染病[1]。布魯氏菌是兼性胞內寄生的革蘭氏陰性球桿菌，無芽胞，無鞭毛，不運動，具有強烈的致病性；對營養需求高，生長最適溫度為37 ℃[2-3]。其根據抗原性和主要宿主分為9個種，21個型：豬布魯氏菌（5個生物型：1、2、3、4、5）、牛布魯氏菌（7個生物型：1、2、3、4、5、6、9）、羊布魯氏菌（3個生物型：1、2、3）、綿羊附睪布魯氏菌、犬布魯氏菌、沙林鼠布魯氏菌、鰭布魯氏菌、鯨布魯氏菌和田鼠布魯氏菌[4-5]。

羊、牛、豬種布魯氏菌屬于光滑型布魯氏菌，均可感染人；犬種布魯氏菌屬于粗糙型菌株，主要感染犬類動物，臨床上可引起母犬流產或不孕、公犬附睪炎等[5, 6]。豬、牛、羊布魯氏菌也可感染犬，且多為隱性感染，1931年首次報道了豬布魯氏菌感染犬的病例[7]。豬、牛、羊布魯氏菌毒力強，感染犬后可作為傳染源傳染給人，而犬與人接觸密切，因此對人類危害更大[8]。隨著社會經濟發展和人們生活水平的提高，人們飼養犬的數量逐年增多，從而人們與犬的接觸越來越密切，導致犬布魯氏菌病的發病數量和受感染人群逐年遞增，該病對人類健康和公共衛生安全所帶來的危害也日趨嚴重，應加大對其的研究與防治[9, 10]。

本試驗對從寵物犬全血中分離到的一株疑似布魯氏菌(命名為sp JX)進行純化培養、染色鏡檢，采用PCR擴增其16S rDNA基因片段并進行測序，用NCBI軟件對測序結果進行同源性檢索，并用DNAStar軟件進行16S rDNA序列相似性分析，最終確定該菌株為布魯氏菌。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料及來源 來自于就診江西農業大學獸醫院的某疑似感染布魯氏菌病的發病犬，從全血中分離得到該菌。

1.1.2 主要培養基及試劑 血瓊脂培養基，由本實驗室自制；PCR Mix、100 bp DNA Ladder，購自北京全式金生物科技有限公司；飽和酚、溴化乙錠（EB），購自上海生工生物工程股份有限公司；膠回收試劑盒，購自Omega公司；Tris堿，購自Solarbio公司；SDS、Agarose，購自Sigma公司。

1.1.3 主要設備 凈化工作臺(型號為SW-CJ)，購自蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸氣滅菌器(型號為YXQ-LS-75S11)、生化培養箱(型號為SPX-150B-Z)，購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠；冷凍臺式高速離心機(型號為5415R)，購自Eppendorf公司；PCR儀(型號為K960)，購自杭州晶格儀器有限公司。

1.1.4 引物設計 分離株的16S rDNA基因序列的擴增采用細菌16S rDNA通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：

16S(F)5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，

16S(R)5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 無菌取發病犬的全血涂布于血瓊脂培養基，將培養基置于燭缸內，在37 ℃溫箱中培養5~7 d后進行觀察，挑取可疑單個菌落進行純化培養。

1.2.2 染色鏡檢 分別勾取純化培養的單個菌落進行涂片，經革蘭氏染色和柯茲洛夫斯基染色，油鏡鏡檢，觀察記錄其形態特征。

1.2.3 細菌16SrDNA鑒定 （1）細菌DNA提取。取1.5 mL規格離心管，加入無菌雙蒸水100 μL，勾取上述純化培養的菌落2接種環于離心管中，95~100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min離心5 min，取上清，作為細菌DNA模板，-20 ℃保存備用[11]。

（2）細菌16SrDNA的PCR擴增。PCR反應體系：總體積為25 μL，其中含16S(F)和16S(R)各1 μL、PCR Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL以及ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，34個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，30 min后在紫外燈下觀察結果，并拍照記錄。

（3）16S rDNA測序與序列分析。用膠回收試劑盒回收目的片段，將純化回收的目的片段送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。運用NCBI基因庫中的BLAST對分離株測序所得序列進行同源性檢索和分析對比，并用DNAStar對分離株和NCBI上布魯氏菌菌株16S rDNA基因序列進行相似性比對分析。相似性>99%定義為種，相似性在95%~99%則定義為屬，相似性<95%則定義為科[12]。

2 結 果

2.1 染色鏡檢結果

結果表明，分離株經柯茲洛夫斯基染色為紅色短桿狀（圖1），革蘭氏染色為革蘭氏陰性球桿菌（圖2），初步懷疑其為布魯氏菌。

2.2 細菌16S rDNA基因擴增結果

PCR擴增結果如圖3，可見有一條清晰的DNA條帶，大小約1 500 bp，與預期大小相符。

圖1 柯茲洛夫斯基染色結果（10×100）

圖2 革蘭氏染色結果（10×100）

a為100 bp Marker，b為細菌16S rDNA

2.3 序列分析

分離株. sp JX測序所得目的序列大小為1 335 bp，與預期大小相符。. sp JX基因序列與NCBI基因庫中的布魯氏菌16S rDNA基因序列進行同源性分析對比，顯示該序列與布魯氏菌同源性達100%；用DNAStar對分離株. sp JX和NCBI上布魯氏菌菌株16S rDNA基因序列進行相似性比對分析，結果顯示與已知布魯氏菌菌株16S rDNA基因序列相似性達99.6%~100%（圖4）。

參考菌株為：羊布魯氏菌（B. ovis）、流產布魯氏菌（B. abortus）、豬布魯氏菌（B. suis）、馬爾他布魯氏菌（B. melitensis）、犬布魯氏菌（B. canis）、田鼠布魯氏菌（B. microti）、紅布魯氏菌（B. inopinata）、帕皮布魯氏菌（Brucella.）、狐貍布魯氏菌（B. vulpis）

3 小結與討論

布病常用檢測方法主要包括細菌學和免疫學。傳統的細菌學檢測技術準確可靠，但操作繁瑣，時間較長，且存在較大的實驗室生物安全隱患[13]。核酸序列分析技術具有快速、準確、特異性強等優點，其中，16S rDNA序列分析技術已成為鑒定細菌種屬的重要方法[14]。本試驗運用16S rDNA序列同源性分析對疑似感染布魯氏菌寵物犬進行了鑒定，確診了寵物犬感染布魯氏菌的病例，結果也進一步證實了16S rDNA序列同源性分析技術鑒定布魯氏菌的準確性和可行性。

但是單純的16S rDNA序列分析也有其缺點，上述通過對分離株. sp JX與各布魯氏菌菌株16S rDNA基因序列進行相似性比對分析表明，單純的16S rDNA序列分析不能對布魯氏菌進行種和基因分型鑒定，因此需要進一步通過多重PCR、AMOS-PCR、Rep-PCR、MLST、MLVA技術[15]等方法對布魯氏菌屬做進一步種型鑒定。

布魯氏菌病是世界性的人畜共患慢性傳染病。目前，全球多個國家和地區仍廣泛流行犬布魯氏菌病[16]，且發病數量和受感染人群呈逐年上升趨勢。犬種布魯氏菌主要感染犬，豬、牛、羊以及人類對犬種布魯氏桿菌易感性低。但犬可感染豬、牛、羊種布魯氏菌，所以人類感染布魯氏菌病的主要傳播途徑可能是接觸了感染豬、牛、羊種布魯氏菌的犬，且豬、牛、羊種布魯氏菌毒力強，因此給人帶來的危害更大。本次從流產犬中分離到布魯氏菌提供了參考，但仍不能確定是牛、羊種或犬種布魯氏菌，還需送檢到微生物三級生物安全實驗室進行進一步鑒定。

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Isolation of Brucella on Pet Dogs as well as Its 16S rDNA Sequence Identification

HUANG Cui1, LIU Lin-feng2, ZHANG Xiong-hua2, DENG Xian-cai2, WU Xiang-dong1*

(1. School of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Partridge Veterinary Hospital, Nanchang 330013, China)

A strain of bacteria from the whole blood of a suspected Brucella-infected pet dog was isolated, purified, stained and microscopically examined, and the 16SrDNA gene fragment was amplified by PCR. The amplified product was purified and sequenced, and then NCBI software was used. The results showed that its homology with Brucella reached 100%; 16SrDNA sequence similarity analysis was performed by using DNAStar software, and it was found that the nucleotide sequence similarity between the isolated strain and Brucella 16S rDNA was between 99.6% and 100%, indicating that the isolated strain was Brucella, but whether the isolated strain wasorremains to be further studied.

pet dog; Brucella; 16SrDNA

S829.2

A

2095-3704（2018）04-0290-04

2018-11-01

2018-12-04

黃萃（1995—），女，碩士，主要從事動物病原及免疫學，1415365418@qq.com；

鄔向東，副教授，dxywxd2006@126.com。

10.3969/j.issn.2095-3704.2018.04.60

黃萃, 劉林峰, 張祥華, 等. 寵物犬布魯氏菌的分離與16S rDNA序列鑒定[J]. 生物災害科學, 2018, 41(4): 290-293.