氣相色譜-串聯質譜法測定蛋和蛋制品中氟蟲腈及其代謝物殘留量

柳 菡，龔玉霞，王繩蕓，余可垚，李靜靜，沈偉健，丁 濤，伊雄海，鄧曉軍，徐敦明，趙增運，吳 斌，張 睿，韓 深

(1.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210019；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；3.廈門出入境檢驗檢疫局，福建 廈門 361026；4.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026)

自歐洲“毒雞蛋丑聞”[1]被公開以來，大量雞蛋及雞蛋類產品從歐洲各大超市下架。歐盟十五國、瑞士、韓國、香港和臺灣地區也都發現了被殺蟲劑氟蟲腈污染的雞蛋。氟蟲腈[2]是一種苯基吡唑類殺蟲劑，殺蟲譜廣，其作用機制為阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制的氯化物代謝，對魚、蝦、蜜蜂、家蠶高毒，持效期長，對環境極其不友好。氟蟲腈在中性和酸性溶液中穩定，在堿性溶液中緩慢水解，光照下緩慢降解，在水溶液中經光照可快速分解。氟蟲腈有光解產物氟甲腈，氧化產物氟蟲腈砜和還原產物氟蟲腈硫醚3種主要的代謝產物[3]。

歐盟對蛋中氟蟲腈(以氟蟲腈和氟蟲腈砜之和計)限量為0.005 mg/kg[4]；日本對蛋中氟蟲腈的限量要求為0.02 mg/kg[5]；中華人民共和國農業部等三部委第1157號公告[6]規定，我國自2009年10月1日起禁用氟蟲腈，衛生用、玉米等部分旱田種子包衣劑除外；GB 2763—2016[7]規定，糧谷、油料、蔬菜、水果、糖料和食用菌中氟蟲腈(以氟蟲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈砜、氟甲腈之和計)的限量為0.02～0.10 mg/kg。

我國現有的氟蟲腈檢測方法標準有SN/T 1982—2007[8]、SN/T 4039—2014[9]、GB 23200.8—2016[10]、GB 23200.9—2016[11]、GB 23200.7—2016[12]等。上述標準主要針對植物源性產品，目標物只針對氟蟲腈，采用氣相色譜-質譜法和液相色譜-串聯質譜法測定，定量限為0.002～0.066 mg/kg。目前，文獻報道的氟蟲腈檢測方法[13-20]多針對植物源性產品、血漿和尿液樣品，采用乙腈或丙酮提取，分散固相萃取、固相萃取、固相微萃取或液-液萃取凈化，氣相色譜-質譜法、氣相色譜-串聯質譜法或液相色譜-串聯質譜法測定。也有文獻[21-22]報道了水產品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法，分別采用乙腈水溶液和二氯甲烷-丙酮混合溶液提取，經分散固相萃取凈化和液-液萃取-復合固相萃取柱凈化，氣相色譜或氣相色譜-質譜法測定。但液-液萃取和復合固相萃取柱凈化的操作較為繁瑣，使用的有機溶劑量較大；復雜動物源性樣品中干擾較多，氣相色譜法的定性能力較弱，難以滿足分析要求。

目前，蛋及蛋制品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法有液相色譜-串聯質譜法[23]、氣相色譜-質譜(負化學源)法[24]和液相色譜-四極桿飛行時間質譜法[25]。時逸吟等[23]采用含0.1%甲酸的乙腈溶液提取雞蛋、雞肉等食品中的氟蟲腈及其代謝物，經無水硫酸鎂、氯化鈉和檸檬酸鈉鹽析，分散固相萃取凈化后，采用液相色譜-串聯質譜法檢測。沈偉健等[24]采用乙腈提取雞蛋和蛋制品中的氟蟲腈及其代謝物，經分散固相萃取凈化后，氣相色譜-負化學源質譜法檢測。郭德華等[25]采用0.1%甲酸乙腈溶液提取雞蛋、蛋糕等食品中氟蟲腈及其代謝物，經固相萃取凈化，液相色譜-四極桿飛行時間質譜法測定。但未見采用氣相色譜-串聯質譜法測定蛋和蛋制品中氟蟲腈及其代謝物的報道。

本研究擬采用QuEChERS技術[26]從提取溶劑、鹽的選擇和用量、分散固相萃取劑的選擇和用量，對氟蟲腈回收率的影響進行考察，優化前處理方法，采用氣相色譜-串聯質譜法檢測氟蟲腈及其代謝物的殘留量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B-7000C氣相色譜-串聯質譜儀：美國Agilent公司產品；KQ-250DE超聲儀：中國昆山市超聲儀器有限公司產品；XW-80A渦旋混勻器：中國上海醫大儀器廠產品；LDZ5-2離心機：德國Sigma公司產品；Milli-Q去離子水發生器：美國Millipore公司產品；旋轉蒸發儀：瑞士Buchi公司產品。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈硫醚和氟蟲腈砜標準物質：純度均大于99%，德國Sigma公司產品；乙腈(色譜純)：德國Merck公司產品；乙腈、冰醋酸、氯化鈉：均為分析純，南京化學試劑有限公司產品；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、十八烷基硅烷(C18)：賽分科技有限公司產品；實驗用水為Milli-Q去離子水；雞蛋、蛋粉、冰蛋和皮蛋樣品：均購自超市。

1.2 溶液的配制

1.2.1標準儲備液的配制 分別稱取適量的標準物質，用乙腈溶解，配制成1.0 g/L的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。

1.2.2混合標準溶液的配制 分別移取適量的標準儲備液，用乙腈配制成1.0 mg/L的混合標準溶液，于-18 ℃避光保存。

1.2.3基質標準工作溶液的配制 量取一定體積的混合標準溶液，根據需要用陰性樣品提取凈化后，將溶液稀釋成適用濃度的基質標準工作溶液，現用現配。

1.3 前處理方法

1.3.1提取 準確稱取適量的樣品(10 g鮮蛋和冰蛋，5 g蛋粉和皮蛋，精確至0.01 g)至50 mL塑料離心管中，加適量的水(鮮蛋和冰蛋加5 mL水，蛋粉和皮蛋加10 mL水)，渦旋30 s，充分混合均勻；加入25 mL 0.1%冰醋酸乙腈溶液，渦旋1 min；加入5 g氯化鈉，劇烈振搖1 min；超聲提取15 min，以8 000 r/min離心3 min，取上層清液至雞心瓶中；向殘渣中再加入15 mL 0.1%冰醋酸乙腈溶液，劇烈振搖1 min；超聲提取15 min，以8 000 r/min離心3 min，取上層清液，合并2次上清液至雞心瓶；于40 ℃水浴中，旋轉蒸發至干。

1.3.2凈化 向樣品提取物中加入適量的乙腈(鮮蛋和冰蛋加2.0 mL，蛋粉和皮蛋加1.0 mL)，渦旋1 min，將溶液轉移至預先加入100 mg PSA、150 mg GCB、50 mg C18的試管中，渦旋1 min，過0.22 μm有機濾膜至進樣小瓶，待GC-MS/MS分析。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：HP-5MS 彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度70 ℃，以25 ℃/min升至300 ℃，保持2.8 min；載氣(He)流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；脈沖不分流進樣(脈沖壓力1.72×105Pa)，1.50 min后打開分流閥；進樣口溫度270 ℃。

1.4.2質譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；碰撞氣：高純氮氣(≥99.999%)；數據采集模式：多反應監測模式(MRM)，詳細信息列于表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的多反應監測信息Table 1 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters of fipronil and its metabolites

注：*表示定量離子

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

本研究采用QuEChERS法從提取溶劑、提取方式、鹽的選擇和用量、分散固相萃取劑的選擇和用量4個方面進行優化。由于氟甲腈、氟蟲腈硫醚、氟蟲腈、氟蟲腈砜4種化合物中氟蟲腈在GC-MS/MS上的響應最低，且4種化合物隨條件變化的規律一致，故以氟蟲腈為代表，通過比較不同條件下氟蟲腈的回收率變化，優化前處理條件。

2.1.1提取溶劑的選擇 提取溶劑應對氟蟲腈及其代謝物有較好的溶解性，而對樣品基體里的雜質有盡量低的提取能力，同時具有沉淀蛋白的作用。根據氟蟲腈及其代謝物的溶解性、極性和穩定性，本研究分別考察了乙酸乙酯、丙酮、乙腈、0.1%冰醋酸乙腈溶液作為提取溶劑的提取效果。丙酮和乙腈與水互溶，為了改善沉淀蛋白的效果，促進待測物向有機溶劑中轉移，需要在提取后加入適量的氯化鈉，以除水并鹽析。乙酸乙酯提取液比丙酮、乙腈、0.1%冰醋酸乙腈的提取液渾濁，可能是由于乙酸乙酯對油脂有一定的提取能力；丙酮提取液顏色比其他提取液深，可能是由于丙酮對色素的提取能力較強。GC-MS/MS分析結果表明，經4種溶劑提取后，氟蟲腈樣品峰面積均大于等濃度標準溶液峰面積，即存在一定的基質增強效應。因此，配制各溶劑條件下同等濃度基質標準溶液，以單點法校正各溶劑條件下的加標回收率，結果列于表2。實驗最終選擇0.1%冰醋酸乙腈作為提取溶劑。

2.1.2提取方式的選擇 為了盡量完全提取蛋及蛋制品中的氟蟲腈及其代謝物，需要使樣品充分稀釋或分散，使提取溶劑充分滲透，并混合均勻。常用的提取方式有振搖、渦旋、超聲、振蕩等。鮮蛋和冰蛋樣品含有一定的水分，向10 g樣品中加入5 mL水可以充分稀釋和混勻，加入提取溶劑后渦旋即可充分滲透，確保后續超聲提取的效果。蛋粉和皮蛋樣品中含水量較少，向10 g樣品中加入5 mL水，仍呈較濃稠的糊狀，加入提取溶劑后，渦旋、超聲或猛烈振搖均不能實現充分滲透。故將蛋粉和皮蛋樣品的稱樣量減至5 g，加水量增至10 mL，樣品得到充分稀釋，形成混懸液，加入提取溶劑后，渦旋能夠使提取溶劑充分滲透，后續的超聲提取完全。對超聲提取時間進行考察，結果表明超聲10 min以上時，回收率無顯著增加，但為了保證充分提取，選擇超聲提取15 min。

表2 不同提取溶劑對氟蟲腈的提取效率(n=2)Table 2 Extraction efficiency of fipronil with different extraction solvents (n=2)

2.1.3分散固相萃取劑的選擇和用量

QuEChERS法常使用分散固相萃取劑(如十八烷基硅烷(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳黑(GCB))以達到除雜凈化的目的。C18可除去基質中脂肪等弱極性化合物；PSA可除去基質中有機酸等極性化合物；GCB可吸附色素等物質。本研究以此為三因素，選擇50、100、150 mg 3個質量水平，以正交實驗法進行優化，實驗設計和結果列于表3。可以看出，各凈化條件下均存在一定的基質增強效應， GCB是影響凈化效果最重要的因素，隨著GCB量的增加，回收率降低，即基質增強效應減弱，故選擇GCB加入量150 mg；隨著PSA量的增加，回收率降低，即基質增強效應減弱，當加入100 mg以上時，對回收率沒有顯著影響，故選擇PSA加入量100 mg；C18量的增加對回收率沒有顯著影響，為在達到凈化目的的前提下使用較少的凈化劑，故C18加入量為50 mg。

2.1.4基質效應 按上述確定的凈化條件配制基質標準溶液，同時配制未經凈化的基質標準溶液，與溶劑標準溶液同時進行分析，峰面積結果列于表4。凈化后基質標準溶液中氟蟲腈峰面積是同等濃度溶劑標準溶液峰面積的140%，而未經凈化的基質標準溶液中氟蟲腈峰面積是同等濃度溶劑標準溶液的261%。可見，采用優化后的分散固相萃取條件凈化樣品，基質增強效應可大幅度降低，但是仍存在一定的基質增強，為了定量的準確性，采用基質校正曲線定量。

2.2 儀器條件的優化

在不同的碰撞能量下，采用GC-MS/MS法分析氟蟲腈及其代謝物標準溶液，優化后的最佳母離子/子離子對和碰撞能量列于表1。陰性鮮雞蛋基質標準溶液的GC-MS/MS譜圖示于圖1。

表3 正交實驗的結果Table 3 Results of orthogonal experiment

表4 樣品凈化前后的基質效應Table 4 Matrix effect of sample before and after purification

注：a.氟甲腈；b.氟蟲腈硫醚；c.氟蟲腈；d.氟蟲腈砜圖1 陰性鮮雞蛋基質標準溶液(2.0 μg/L)的GC-MS/MS圖Fig.1 GC-MS/MS spectrum of fipronil and its metabolites in negative chicken egg extraction solution (2.0 μg/L)

2.3 方法的線性范圍、標準曲線和定量限

以標準品的峰面積(y)為縱坐標，質量濃度(x，μg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。在2～100 μg/L濃度范圍內，氟蟲腈及其代謝物具有良好的線性關系，線性相關系數R2≥0.99。以信噪比等于10確定方法的定量限為1.0 μg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

選擇1.0、2.0、4.0、20.0 μg/kg四個加標水平對鮮雞蛋、全蛋粉、冰蛋和皮蛋進行加標實驗，回收率為72.0%～109.5%，精密度為7.8%～15.8%，具體數據列于表5。

2.5 實際樣品檢測

采用本研究建立的方法對市售的200批蛋和蛋制品進行檢測，結果表明，氟蟲腈及其代謝物均小于本方法的定量限。

3 結論

本研究采用改進的QuEChERS法提取和凈化樣品，建立了蛋和蛋制品中氟蟲腈及其代謝物殘留量的GC-MS/MS檢測方法。該方法準確、靈敏、簡便，回收率和精密度均能夠滿足蛋和蛋制品中氟蟲腈及其3種代謝物的檢測要求，可為蛋及蛋制品中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定提供方法參考。