脾腎虧虛型重癥肌無力患者血清miRNA表達差異的初步研究

姜 超，王 婷，徐中菊

(1西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西 西安710038；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海200032；3西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院信息科,陜西 西安710038；4上海浦南醫(yī)院,上海200125)

0 引言

目前,關(guān)于miRNA與免疫系統(tǒng)相關(guān)性的研究報道日益引起人們的重視,相對于臨床上容易獲得的血清樣本,我們有理由相信,對獲得與免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病、進展或臨床治療緊密關(guān)聯(lián)的血清miRNA進行深入地相關(guān)研究無疑是目前很好的思路。迄今為止,關(guān)于miRNA和重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)之間可能的關(guān)系鮮有報道。已知MG是一種典型的依賴T細(xì)胞且B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,雖然對于其發(fā)病機制的探索一直從未停止,但和其他的自身免疫性疾病一樣,對于觸發(fā)其發(fā)病的源頭依然不是很清楚。在中醫(yī)上,對MG尚無完備記載,但從其病機和臨床表現(xiàn)分析,當(dāng)屬虛損之“痿證”范疇,結(jié)合我們前期研究發(fā)現(xiàn),其病位可主要定于脾腎［1－2］。那么,基于病癥結(jié)合的理論指導(dǎo)去深入分析脾腎虧虛型(spleen and kidney deficiency type,SKDT)MG血清miRNA表達的相關(guān)研究對于未來探索新的治療MG的方法很有意義,值得進一步深入研究。

1 資料和方法

1.1 臨床病例來源研究的34例MG患者來源于2010年11月至2012年4月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院以及遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診,全部符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)。患者年齡為14～75歲。受試者被告知,自愿簽署知情同意書。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合MG基本診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］,包括重復(fù)刺激神經(jīng)肌肉傳遞障礙的肌電圖模式的波動性,肌無力癥狀支持,為改良OssemanⅠ型,ⅡA型、ⅡB型。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合中醫(yī)痿證基本診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。凡具備主證1項和次證1項以上,或兼見舌苔脈象即可。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①Osseman方案Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型者。②家族性MG,先天性MG綜合證及藥物(青霉胺、α-干擾素等)所致MG。③妊娠或哺乳期婦女。④有合并證的疾病,如腦血管疾病、腎功能不全、造血系統(tǒng)疾病、精神疾病的患者。⑤過敏體質(zhì)(對2種以上食物或藥物過敏者)。⑥近1個月內(nèi)參加過其他藥物臨床試驗。⑦近3個月內(nèi)曾靜脈應(yīng)用丙種球蛋白或行血漿置換治療的患者。按照排除標(biāo)準(zhǔn)進行排除。本研究由龍華醫(yī)院的倫理審查委員會批準(zhǔn),并獲得所有參與研究的書面許可。

1.2 血清樣本的收集和處理①對每名研究對象采用非抗凝真空采血管空腹采集血液樣品6 mL；②血樣采集完畢后,盡快(1 h內(nèi))室溫下普通離心機3500 rpm/min,離心5 min；③可見上層血清,將上層血清小心取出,分裝至滅菌凍存管中并標(biāo)記,置于－80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩＂苓M行樣本簡要信息記錄,包括樣本編號、研究對象一般資料,病史材料、CRF表填寫。

1.3 總miRNA的提取及純化采用TRIzol Reagent和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit對血清miRNA進行提取、分離。抽提過程參照試劑盒(mirVana RNA Isolation Kit-Applied Biosystem p/n AM1560)說明規(guī)范進行。

1.4 芯片檢測miRNA干冰運輸送到上海豪伯生物技術(shù)有限公司進行Agilent人類miRNA array雜交(v.12.0)。每個芯片雜交標(biāo)記Cy3或Cy5的單個樣品。按照背景減法和規(guī)范進行。miRNA芯片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：2100 RIN＞＝6.0且28S/18S＞＝0.7,通過后才可以進行下一階段研究。

1.5 數(shù)據(jù)收集處理和統(tǒng)計學(xué)方法分析實驗結(jié)果運用使用2－ΔΔCT法測定了各組細(xì)胞中miRNA的相對表達水平。

計算公式：ΔCt＝檢測基因 Ct值的平均值－管家基因(U6 snRNA)Ct值得平均值。ΔΔCt＝待測組ΔCt－對照組 ΔCt。 因此待測基因的表達量由 2－ΔΔCt來進行計算。結(jié)果表示miRNA在MG患者于正常人表達倍數(shù)。

1.6 統(tǒng)計分析臨床樣本統(tǒng)計分析使用Mann-Whitney檢驗,以評估不同分組之間的統(tǒng)計學(xué)意義。每個實驗數(shù)據(jù)表示為±s。統(tǒng)計分使用Graphpad 5.0軟件繪圖,P＜0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)均平行3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的一般資料比較SKDT-MG患者中女18例,男16例,年齡17～75歲,平均48.70歲；正常人群中女5例,男5例,年齡20～70歲,平均46.5歲。兩組人群年齡、性別構(gòu)成比均衡,具有可比性(P＞0.05,表 1)。

表1 入組病例性別、年齡分布組間比較(例)

2.2 總RNA的純度分析和質(zhì)量檢測Agilent miRNA芯片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：RIN＞＝6.0且28S/18S＞0.7。抽提的RNA質(zhì)量符合質(zhì)控要求,可進行芯片雜交實驗(表2)。

表2 抽提的RNA質(zhì)量合格樣本

2.3 MG組較正常組差異表達的miRNA篩選由于芯片檢測過程中,每組僅有3張芯片,重復(fù)隨機樣本數(shù)量較少難以達到標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布。為了減少小樣本造成的差異篩選誤,利用隨機方差模型(random variance model,RVM)修正的F檢驗計算差異,檢驗計算差異miRNA間差異的顯著性水平(P-value)和誤判率(FDR),從而得到差異miRNA。治療前,使用RVM對MG組和正常人組的差異性miRNA進行分析發(fā)現(xiàn),總共篩選到43個差異性miRNA(差異倍數(shù)大于2倍),其中MG組較正常人組上調(diào)的miRNA有21個(表3),下調(diào)的miRNA有22個(表4)。采用Cluster 3.0和TreeView programs對差異表達的數(shù)據(jù)進行聚類分析,并制作熱圖(圖1)。

表3 MG組較正常組表達上調(diào)的miRNA

表4 MG組較正常組表達下調(diào)的miRNA

圖1 MG組較正常組差異表達miRNA聚類分析熱圖

3 討論

MG是一種抗體介導(dǎo),神經(jīng)肌肉接頭傳遞的慢性疾病,發(fā)病率為每年8/10萬～20/10萬人,其靶點是突觸后蛋白,主要涉及骨骼肌乙酰膽堿膽堿受體(AchR)和特定肌肉的酪氨酸激酶［5－6］。 研究［6］認(rèn)為,遺傳因素在MG發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。此外,病毒或細(xì)菌感染,如脊髓灰質(zhì)炎病毒和大腸桿菌,也可能參與了MG的發(fā)病［7－8］。然而,目前還沒有任何報告可以非常清楚地闡明其基本發(fā)病機制,現(xiàn)存的僅是一些公認(rèn)的假說,MG復(fù)雜疾病的發(fā)病機制,已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了我們對疾病發(fā)生發(fā)展的理解,從而延緩了對易感個體的識別和治療。該病的主要臨床特征是骨骼肌無力癥狀的波動性。目前,抗膽堿酯酶藥、非特異性的免疫抑制劑、胸腺切除術(shù)和血漿置換仍然是治療MG的主要方法［9－11］。不幸的是,上面所言及的治療措施具有一些嚴(yán)重的副作用,如心律失常、骨質(zhì)疏松癥和低血壓,并不能抑制患者癥狀的復(fù)發(fā),而達到完全緩解［12］。顯然,有必要去更深入地探討MG發(fā)病機制,尋求具有較高療效和較少副作用的替代治療MG的措施,這無疑成為研究的一個熱點。中國傳統(tǒng)醫(yī)藥(Traditional Chinese Medicine,TCM)由于其長期的療效性以及較少的副作用,已經(jīng)被用來治療許多疾病,包括癌癥、心血管疾病、炎癥和 MG 疾病［13－17］。

MicroRNAs(miRNA)(19～22個核苷酸長)是一種小非編碼RNA,其介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默。在動物中,miRNA通常在靶基因3′非翻譯區(qū)(UTR)的互補位點結(jié)合,并調(diào)節(jié)靶基因的表達,無論是翻譯抑制,mRNAs的降解,或者兩者全部［18］。自從 miRNA的發(fā)現(xiàn),學(xué)者們就一直致力于確定miRNA及其相關(guān)的疾病生物學(xué)功能。miRNA的失調(diào)一直伴隨著人類的某些疾病,如白血病和心臟疾病［19－20］。 在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中,miRNA作為一個重要因素的出現(xiàn),他們的表達特征與慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌的預(yù)后和進展相關(guān)［21－22］。

生物信息學(xué)是最近興起的一門將生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、信息學(xué)等學(xué)科交叉銜接起來的學(xué)科,目的是通過信息學(xué)的技術(shù)手段解決生命科學(xué)問題。生物信息學(xué)以其快速、方便、準(zhǔn)確、靈活的特點正在生－命科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。在miRNA研究領(lǐng)域也不例外,從miRNA研究的最開始到現(xiàn)在,生物信息學(xué)都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,生物信息學(xué)在miRNA識別、miRNA靶基因預(yù)測、miRNA功能分析、miRNA關(guān)聯(lián)疾病分析、miRNA上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析,SNP分析以及miRNA-藥物相互作用分析等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用,并得到越來越多的應(yīng)用。

本研究采用了Agilen公司的miRNAs芯片產(chǎn)品,其具有特殊的芯片生產(chǎn)工藝,所以實驗檢測的靈敏度得到了極大的提高,且簡化了操作步驟。同時不需要將總RNA純化或者濃縮就可特異性檢測出成熟的miRNA,這樣就會大大避免濃縮或純化總RNA的過程中造成miRNA損失帶來的檢測誤差。因為芯片雜交數(shù)據(jù)的可靠性會受到芯片探針數(shù)目、樣品質(zhì)量、檢測靈敏度等因素的影響,所以我們在數(shù)據(jù)分析前首先對原始數(shù)據(jù)進行篩選。且芯片雜交的熒光信號值需達到一定值才可認(rèn)定其探針雜交信號有效,即芯片信號在掃描后會去掉假陽性或假陰性信號,從而提高芯片檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時為了消除不同芯片所帶來的系統(tǒng)誤差,會將樣品檢測結(jié)果的所有原始數(shù)據(jù)都進行中位數(shù)分析,再進行數(shù)據(jù)分析。最后,只有檢測出有效信號值的miRNA才能進入下一步分析。因為芯片技術(shù)具有高通量的特點,所以會產(chǎn)生巨大的數(shù)據(jù)信息。高水平的數(shù)據(jù)分析不僅可以為我們找到一些重要的發(fā)現(xiàn),同時還能發(fā)掘出更多的生物學(xué)信息,為我們的進一步研究提供準(zhǔn)確的信息。所以對于高通量實驗設(shè)計特別是芯片檢測實驗,數(shù)據(jù)分析決定了芯片實驗的成功與否。在本試驗中,我們判斷兩個樣本校正后數(shù)據(jù)是否存在差異,主要是通過差異倍數(shù)和P值,只有當(dāng)P＜0.05且差異倍數(shù)大于2時,我們才認(rèn)定其差異有統(tǒng)計學(xué)意義,對于無法進行生物學(xué)統(tǒng)計的數(shù)據(jù),我們則采取差異倍數(shù)大于2的標(biāo)準(zhǔn),這些都是符合了一般數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)。然而,由于存在儀器檢測靈敏度、效率以及樣本質(zhì)量等因素,那么對于設(shè)定嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)去篩選miRNA,仍需要大樣本進一步研究驗證后才能真正確定其客觀的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

本試驗運用miRNA芯片技術(shù)對正常人和MG患者的血21條,顯著表達下調(diào)的有22條。采用Cluster3.0和TreeView programs對差異表達的數(shù)據(jù)進行聚類分析。根據(jù)已篩選出的差異miRNA,進一步篩選出MG組的miRNA表達差異。并結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論分型,初步證明SKDT-MG患者血清存在著確切的差異性miRNA表達譜,參考國內(nèi)外最新的文獻報道,依據(jù)篩選的血清miRNA表達量的高低,進一步選擇特異性的血清miRNA予以驗證。那么,基于外周血清miRNA的差異性表達以及中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論對于疾病分型,進一步探索SKDT-MG的發(fā)病機制,研究通過血清miRNA信號途徑干預(yù)SKDT-MG的臨床作用機制,盡早地對MG進行有效診斷干預(yù),無疑具有重要的臨床和科研意義。