蘇州市患病水生動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

馮永杰，孫振麗，宣引明，蔣 明，潘云生，張益明，龔葉平，薛仁宇，胡小龍，曹廣力，貢成良

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123；2.昆山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇蘇州 215300)

魚類的細(xì)菌性疾病是一類嚴(yán)重危害魚類健康的疾病，常造成水產(chǎn)養(yǎng)殖的嚴(yán)重?fù)p失，很多疾病的爆發(fā)能引起水生動(dòng)物大面積的死亡。目前，發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)菌性疾病有淡水魚出血性敗血癥、潰瘍病、爛鰓病、愛德華氏病等。水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象感染水生動(dòng)物的細(xì)菌種類很多，不同細(xì)菌感染往往使患病魚呈現(xiàn)不同的癥狀，生產(chǎn)上的細(xì)菌性疾病往往表現(xiàn)出一病多癥、一癥多病，從而給細(xì)菌性疾病的防治帶來了極大的困難。

抗生素對(duì)水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病有良好的防治效果，自1945年磺胺藥成功應(yīng)用于治療鱒癤瘡以來，土霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星、呋喃唑酮、惡喹酸、四環(huán)素、新霉素等相繼在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用[1]。不同的細(xì)菌對(duì)不同的抗生素敏感性存在很大差異，由于生產(chǎn)上對(duì)細(xì)菌性病原沒有進(jìn)行分離、鑒定，也沒有進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，隨意選擇抗生素進(jìn)行治療往往導(dǎo)致防治效果很不理想。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性也不斷增強(qiáng)[2-3]，耐藥菌，尤其是多重耐藥菌的不斷增加[4]，給水生生物的細(xì)菌病的治療帶來極大的困難。

為了解蘇州市不同地區(qū)水生動(dòng)物中致病菌的種類及耐藥性，指導(dǎo)生產(chǎn)上科學(xué)合理使用抗生素，我們對(duì)2014年6-10月從不同地區(qū)采集的患病中華鱉、蝦、河蟹及魚中分離的細(xì)菌通過16S rRNA基因序列對(duì)分離菌進(jìn)行了鑒定，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)分離菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以此探明不同細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性是否存在明顯差異，為科學(xué)用藥提供方向。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2014年6月15日于蘇州市吳江區(qū)金家壩鎮(zhèn)采集的患病南美白對(duì)蝦(Cyprinuscarpio)；6月19日于蘇州常熟市采集的患病錦鯉(夏花)和草魚(Ctenopharyngodonidellus)；7月1日于蘇州吳中區(qū)采集的患病異育銀鯽(Carassiusaumtusgibelio)；7月11日、9月9日在蘇州昆山市張浦鎮(zhèn)采集的患病中華鱉(Pelodiscussinensis)；9月28日于昆山淀山湖鎮(zhèn)采集的患病異育銀鯽、周市鎮(zhèn)采集的青魚、千燈鎮(zhèn)采集的患病河蟹(Eriocheirsinensis)；10月22日于昆山淀山湖鎮(zhèn)采集的鳙(Aristichthysnobilis)。所有采集的患病水生動(dòng)物均存活，且有明顯的癥狀。

1.2 細(xì)菌分離

首先對(duì)采集患病水生動(dòng)物用75%的酒精體表消毒，在超凈工作臺(tái)中無菌解剖，取小塊肝臟或肝胰腺移入LB液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，取50 μL菌液用無菌水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落在新LB固體培養(yǎng)基中劃線純化培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種LB液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h。

1.3 細(xì)菌基因組抽提、16S rRNA基因克隆與測(cè)序

取新鮮菌液50 μL，煮沸5 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液用作模板，用16S rRNA基因的通用引物27F(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)/1492R(5′-tacggttaccttgttacgactt-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa公司)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，用質(zhì)粒抽提試劑盒(AXYGEN公司)抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4 細(xì)菌鑒定

將測(cè)序獲得的16S rRNA基因序列用在線Blast程序(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源搜尋，根據(jù)所測(cè)序列與GenBank中已公開的細(xì)菌16S rRNA基因序列的相似性確定所分離細(xì)菌的分類地位。

1.5 藥敏試驗(yàn)

1.5.1 紙片擴(kuò)散法

取200 μL菌液(濃度為108cfu/mL)均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基，然后用無菌鑷子將分別加有10 μL(10 mg/mL)的鏈霉素、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、慶大霉素硫酸鹽、甲砜霉素的濾紙片(直徑6 mm)緊貼在培養(yǎng)基表面，于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，同設(shè)無菌水對(duì)照。

1.5.2 倍比稀釋法

將12支無菌薄壁透明EP管排列一排，依次編號(hào)，向第1管加入1 mL LB培養(yǎng)基，其余管各加0.5 mL培養(yǎng)基，然后向第1管中加5 μL(25 mg/mL)抗生素混勻，從中取0.5 mL加到第2管中，混勻后取0.5 mL加到第3管中，依次倍比稀釋到第11管；從第11管中吸出0.5 mL棄去，第12管不加抗生素作對(duì)照。向12支EP管中各加2 μL濃度為108cfu/mL的細(xì)菌懸液。37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果。將未觀察到待檢菌繁殖的最低藥物濃度定義為最低抑菌濃度。

1.5.3 細(xì)菌耐藥情況判定

參考動(dòng)物源細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI，2013)，分別以敏、中敏和耐藥三種形式對(duì)細(xì)菌的MIC進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 分離菌中的質(zhì)粒抽提與電泳檢測(cè)

取1.5 mL新鮮液體培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，按質(zhì)粒抽提試劑盒(AXYGEN公司)說明書提取各分離細(xì)菌的質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。回收具有多重抗性的細(xì)菌的高拷貝質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，涂到帶有氨芐青霉素(0.1 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果，并進(jìn)一步從轉(zhuǎn)化子中抽提質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病水生動(dòng)物的癥狀

患病的南美白對(duì)蝦肝胰臟顏色變深，潰爛，體色失去原有的淡青色；患病錦鯉的皮膚發(fā)炎充血，在水中打圈游動(dòng)；患病的草魚、青魚和鯽都有體表充血、鰭基充血的癥狀；患病的中華鱉行動(dòng)緩慢；患病白鰱的體表充血，脫鱗，鰭基充血。

2.2 基于16S rRNA基因序列的分離細(xì)菌的鑒定

分離到的14種菌的16S rRNA基因序列在GenBank上的登錄號(hào)及與相應(yīng)菌的16S rRNA基因序列的同源性如表1所示。

表1 不同患病水生動(dòng)物中分離細(xì)菌的基本信息Tab.1 Basic information of bacteria isolated from aquatic animals with different diseases

注： 4，5，6，7，8號(hào)，分離于同一條魚體內(nèi)；11，12，14號(hào)分離于同一地區(qū)的不同品種魚體內(nèi)。

2.3 分離菌藥敏試驗(yàn)

2.3.1 紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選擇了鏈霉素、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、慶大霉素硫酸鹽、甲砜霉素的藥敏紙片對(duì)各分離菌進(jìn)行了抗生素的敏感性試驗(yàn)(表2)。結(jié)果顯示，不同分離細(xì)菌對(duì)不同抗生素的敏感程度有很大差異，來源不同的同種細(xì)菌對(duì)某些抗生素的敏感程度也存在一定差異。來源吳中區(qū)的4號(hào)菌(A.veronii)對(duì)慶大霉素的敏感程度高于來源昆山市淀山湖鎮(zhèn)的11、12和14號(hào)同種細(xì)菌(A.veronii)，也高于來源同條魚體內(nèi)的另一種A.veronii即5號(hào)菌，而對(duì)恩諾沙星的敏感性低于5、11、14號(hào)菌。9號(hào)菌為嗜水氣單胞菌，10號(hào)菌為摩根氏菌屬均從中華鱉中分離獲得，9、10號(hào)菌對(duì)6種抗生素均表現(xiàn)出較強(qiáng)的的耐藥性。

表2 分離細(xì)菌對(duì)抗生素的紙片的抑菌圈直徑Tab.2 Results of the disk diffusion test for the isolated bacteria against antibiotics mm

注：濾紙片的直徑：6 mm，每片濾紙抗生素的含量為100 μg；1～14號(hào)細(xì)菌名稱對(duì)應(yīng)于表1。

2.3.2 最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果顯示，最低抑菌濃度因抗生素種類和分離菌的不同而有很大差異(表3)，該結(jié)果所反映的各分離菌的耐藥性與紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。硫酸鏈霉素對(duì)各分離菌的最低抑菌濃度均較高，說明硫酸鏈霉素不適宜用于水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治；試驗(yàn)中所選擇的抗生素對(duì)嗜水氣單胞菌(9號(hào)菌)、摩根氏菌屬(10號(hào)菌)的最低抑菌濃度均較高，說明這2種菌具有較強(qiáng)的多重耐藥性；4、5號(hào)菌為同一條魚中分離到的維氏氣單胞菌，慶大霉素對(duì)5號(hào)菌的最低抑菌濃度比4號(hào)菌的高64倍，而恩諾沙星對(duì)5號(hào)菌的最低抑菌濃度是4號(hào)菌的1/64；而來自同一地區(qū)不同病魚體中分離的同種細(xì)菌(11、12、14號(hào)菌)對(duì)抗生素的敏感性也存在一定的差異。

表3 不同抗生素對(duì)分離菌的最低抑菌濃度Tab.3 The minimum inhibitory concentration of different antibiotics to the isolated bacteria μg/mL

注“1～14號(hào)細(xì)菌名稱對(duì)應(yīng)于表1。s：高敏，s-：中敏，r：耐藥。

14種細(xì)菌對(duì)5種抗生素的耐藥情況見表3。結(jié)果顯示：所有細(xì)菌對(duì)硫酸鏈霉素均表現(xiàn)為耐藥，9號(hào)菌為嗜水氣單胞菌，10號(hào)菌為摩根氏菌屬均從中華鱉中分離獲得，除9號(hào)菌對(duì)慶大霉素表現(xiàn)為高敏外，9號(hào)10號(hào)菌對(duì)其它抗生素均表現(xiàn)為耐藥。5種維氏氣單胞菌A.veronii(4、5、11、12和14號(hào))對(duì)甲砜霉素、強(qiáng)力霉素均表現(xiàn)為高敏，5、12、14號(hào)菌對(duì)慶大霉素中敏，4號(hào)菌對(duì)慶大霉素高敏；5、11號(hào)菌對(duì)恩諾沙星表現(xiàn)為高敏，14號(hào)菌對(duì)恩諾沙星表現(xiàn)為中敏，4、12號(hào)菌對(duì)其耐藥。1號(hào)菌(不動(dòng)桿菌屬)對(duì)恩諾沙星中敏，2、3號(hào)菌(黃桿菌屬)對(duì)試驗(yàn)選擇的抗生素(除硫酸鏈霉素)均為高敏；除硫酸鏈霉素外，6號(hào)菌(弧菌)和7號(hào)菌(弧菌)對(duì)所試驗(yàn)的抗生素均表現(xiàn)出高敏，8號(hào)菌(希瓦氏菌屬)和 13號(hào)菌(A.enteropelogenes)對(duì)所試驗(yàn)的抗生素也均表現(xiàn)出高敏。

2.4 質(zhì)粒檢測(cè)

2.4.1 質(zhì)粒抽提

對(duì)分離菌進(jìn)行了質(zhì)粒抽提和電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖3，表5)，1、2、5、8～12菌中明顯存在質(zhì)粒，其中1和10號(hào)菌可能存在分子量不同的多種質(zhì)粒；同一種細(xì)菌中不同的分離株之間所含質(zhì)粒的情況存在不同，例如同屬于A.veronii的4、5、11、12、14號(hào)菌，5、11、12號(hào)菌可明顯檢測(cè)到質(zhì)粒，而4、14號(hào)菌則幾乎沒有檢測(cè)到。2株耐藥性較強(qiáng)的9號(hào)菌(嗜水氣單胞菌屬)和10號(hào)菌(摩根氏菌屬)均明顯存在質(zhì)粒。

圖3 不同分離菌來源的質(zhì)粒DNA檢測(cè)Fig.3 Detection of plasmid DNA extracted from the isolated bacteria

表4 不同分離菌的質(zhì)粒檢測(cè)Tab.4 Detection of plasmid extracted from the different isolated bacteria

1～14號(hào)細(xì)菌名稱對(duì)應(yīng)于表1。

2.4.2 質(zhì)粒抗性檢測(cè)

將摩根氏菌屬中拷貝數(shù)較高的1.8 kb大小的質(zhì)粒和嗜水氣單胞菌中6 kb的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，涂到帶有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，前者可以觀察到轉(zhuǎn)化子，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測(cè)，其質(zhì)粒的分子量與原質(zhì)粒相同，而后者則未成功得到轉(zhuǎn)化子。說明1.8 kb大小的質(zhì)粒可能與分離菌的氨芐青霉素抗性有關(guān)，而嗜水氣單胞菌中的6 kb大小的質(zhì)粒可能與氨芐青霉素抗性無關(guān)。隨后將9號(hào)菌中的6 kb質(zhì)粒回收，進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，結(jié)果得出6 141 bp的序列(GenBank登錄號(hào)：KR677378.1)，并對(duì)序列進(jìn)行分析，并未發(fā)現(xiàn)抗性基因，可以推測(cè)9號(hào)菌中對(duì)抗生素的抗性與其6 kb質(zhì)粒無關(guān)。

3 討論

目前，水生動(dòng)物中主要分離到的病原菌有氣單胞菌屬的斑點(diǎn)氣單胞菌(Aeromomaspunctata)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、嗜水氣單胞菌，假單胞菌屬的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、白皮假單胞菌(P.dermoalba)、水型點(diǎn)狀假單胞菌(P.punctatafascitae)、類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)，弧菌屬的鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、霍亂弧菌(V.cholerae)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)等，這些細(xì)菌的感染引起水生動(dòng)物發(fā)生多種細(xì)菌性疾病。在本研究中，我們從不同地區(qū)采集的患病南美白對(duì)蝦、河蟹、錦鯉、草魚、鯽、中華鱉、青魚和鳙中分離到不動(dòng)桿菌、黃桿菌、氣單胞菌、弧菌、希瓦氏菌、嗜水氣單胞菌、摩根氏菌，由于這些細(xì)菌均是從患病的活的有癥狀的水生動(dòng)物血液中分離獲得，引起蘇州地區(qū)養(yǎng)殖水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的細(xì)菌種類較多。氣單胞菌的致病范圍十分廣泛，它可導(dǎo)致多種水產(chǎn)動(dòng)物患病，引起大量死亡[5-6]。在本研究中，從患病魚類的血液中分離的細(xì)菌以氣單胞菌屬最多，推測(cè)引起蘇州地區(qū)養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病的主要流行菌為氣單胞菌屬的細(xì)菌。從同一條患病的鯽中可以同時(shí)分離到維氏氣單胞菌、弧菌和希瓦氏菌，表明魚類的細(xì)菌性疾病有時(shí)可以由多種細(xì)菌共同感染引起。

正確使用抗生素是防治水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的有效方法，但是，不同種的細(xì)菌、同一種細(xì)菌的不同的分離株對(duì)抗生素的敏感性存在明顯差異，同時(shí)由于養(yǎng)殖生產(chǎn)上濫用抗生素，細(xì)菌的耐藥性增加，往往導(dǎo)致生產(chǎn)上使用抗生素的治療效果不令人滿意。9號(hào)嗜水氣單胞菌和10號(hào)摩氏摩根菌對(duì)所選擇的抗生素均表現(xiàn)出明顯的耐藥性，特別是摩氏摩根菌，對(duì)硫酸鏈霉素表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐藥性，其最低抑菌濃度>125 μg/mL；從昆山不同患病魚(鯽、青魚、鳙)中分離的維氏氣單胞菌(11、12、14號(hào)菌)對(duì)恩諾沙星表現(xiàn)出不同的敏感性，來自青魚的維氏氣單胞菌(12號(hào))對(duì)恩諾沙星的耐藥性分別比來自鯽(11號(hào)菌)、花鰱(14號(hào)菌)維氏氣單胞菌的高15和3倍，不同魚體來源的同一種細(xì)菌的耐藥性存在明顯不同；同一病魚中存在細(xì)菌種相同但抗性不同的菌株，提示在篩選抗生素時(shí)對(duì)從病魚中分離到同一種細(xì)菌需分別進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中所分離菌對(duì)硫酸鏈霉素均表現(xiàn)出耐藥性，因此，硫酸鏈霉素不太適合用于蘇州市的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中細(xì)菌病防治。通過藥敏試驗(yàn)篩選合適的抗生素用于水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治有重要作用，但是由于不同抗生素在魚體內(nèi)代謝各不相同，往往有可能在體外對(duì)細(xì)菌有作用的抗生素在體內(nèi)不一定能發(fā)揮治療作用，因此，在藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析，對(duì)指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗生素類藥物的正確使用有重要指導(dǎo)作用。

抗菌藥物作用主要是通過干擾病原微生物的生理生化代謝過程產(chǎn)生抗菌作用。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性有多種機(jī)制，部分菌的耐藥性與菌體存在質(zhì)粒有密切關(guān)系[7-8]，本研究的結(jié)果顯示，4、5、11、12和14號(hào)菌均為維氏氣單胞菌，但4和14號(hào)菌中沒有檢測(cè)到質(zhì)粒，因此可以認(rèn)為這二個(gè)菌的耐藥性與質(zhì)粒無關(guān)；而5、11、12號(hào)菌中可檢測(cè)到明顯的質(zhì)粒，且不同菌株之間的質(zhì)粒種類和分子量存在不同，維氏氣單胞菌不同分離株的耐藥性差異是否與其帶有的質(zhì)粒有關(guān)還需進(jìn)一步分析。

摩氏摩根菌的多重耐藥性與其質(zhì)粒含有抗性基因密切關(guān)聯(lián)，從摩氏摩根菌已分離到61 093 bp的R485(GenBank登錄號(hào)：NC_016036.1)、2683bp的pCGH69(GenBank登錄號(hào)：NC_021524.1)和 2 683 bp的pM60(GenBank登錄號(hào)：NC_023901.1)質(zhì)粒，在R485質(zhì)粒中具有與磺類藥物抗性相關(guān)的二氫蝶酸合酶基因，在pCGH69和pM60中均檢測(cè)到編碼喹諾酮類耐藥性蛋白的基因[9]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)從中華鱉中分離到的摩氏摩根菌呈多重耐藥性，并從摩氏摩根菌中檢測(cè)到表觀分子量不同的4種質(zhì)粒(表4)，將表觀分子量為1.8 kb的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌可使其獲得抗氨芐青霉素的性能，表明該質(zhì)粒可賦予摩氏摩根菌獲得氨芐青霉素耐藥性。本研究從摩氏摩根菌分離到的其他質(zhì)粒是否與耐藥性有關(guān)還需進(jìn)一步探討。

嗜水氣單胞菌對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)耐藥性，對(duì)不同的抗生素有不同的耐藥機(jī)制。已有報(bào)道，在對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素以及妥布霉素多重耐藥的嗜水氣單胞菌菌株中，檢測(cè)出9 416 bp、4 361 bp 以及1 925 bp 3 種質(zhì)粒[7-8]，在GenBank已登錄的從不同嗜水氣單胞菌分離到分子量不同的質(zhì)粒有12種，其中質(zhì)粒pRA3(GenBank登錄號(hào)：NC_010919；45 909 bp)中含有鏈霉素-3′-腺苷轉(zhuǎn)移酶基因，編碼氨基糖苷類抗生素抗性蛋白；pBRST7.6質(zhì)粒(GenBank登錄號(hào)：EU925817.1；7 621 bp)中存在喹諾酮類耐藥性基因，而pRA1質(zhì)粒(GenBank登錄號(hào)：NC_012885.1；143 963 bp)是一種IncA/C 多藥物抗性質(zhì)粒，含有四環(huán)素抗性基因和四環(huán)素阻遏蛋白基因。 本研究從嗜水氣單胞菌(9號(hào)菌)檢測(cè)到一種約6 kb的質(zhì)粒，質(zhì)粒全序列測(cè)序結(jié)果(GenBank登錄號(hào)：KR677378.1)顯示，該質(zhì)粒中不存在與抗生素耐藥性有關(guān)的基因序列，因此該嗜水氣單胞菌的多重耐藥性與質(zhì)粒無關(guān)，有必要從細(xì)菌的基因組水平進(jìn)一步深入研究。