嗎啡聯合厄洛替尼對肺腺癌裸鼠成瘤的抑制作用及機制

張雅靜，馬驂，梁歡，相成，張燕

厄洛替尼是一種特異性的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase Inhibitors，EGFR TKIs)，通過競爭性地抑制ATP與受體胞內區結合，從而抑制酪氨酸激酶活化，阻斷EGFR的傳導通路，從而達到治療腫瘤的目的。目前已廣泛應用于EGFR敏感突變的晚期非小細胞肺癌患者的治療，不但使患者的中位生存時間明顯延長，且總體耐受良好[1-2]。嗎啡作為阿片類藥物的代表，廣泛應用于癌痛的治療，極大地提高了腫瘤患者生活質量。但有研究發現，阿片類藥物可能影響腫瘤復發、轉移[3-5]。因此，本文通過建立裸鼠成瘤模型進一步在體內觀察嗎啡聯合厄洛替尼對腫瘤細胞的影響，為其臨床安全應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物： SD雄性裸鼠，4周齡，體質量(15±3)g，購自河北醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產合格證號：SCXK(冀)2013-1-003，于河北科技大學藥用分子實驗室無菌條件下分籠飼養，自由進食飲水；裸鼠適應性喂養1周后，隨機數字表法分為4組，對照組、嗎啡組、厄洛替尼組、嗎啡聯合厄洛替尼組(聯合組)，每組6只。

1.1.2 試劑及藥物： 人非小細胞肺癌細胞(HCC827)(中科院細胞庫),RPMI1640培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，TUNEL檢測試劑盒(Millipore)，BAX (Abcam，ab53154)、Caspase-3(Abcam，ab1384)、Bcl-2(Abcam，ab59348)，厄洛替尼(上海羅氏制藥有限公司)，鹽酸嗎啡片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)。

1.2 裸鼠成瘤模型構建 2017年2—8月于河北科技大學藥用分子實驗室進行實驗。

1.2.1 細胞培養及藥物處理： 使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養HCC827細胞，培養條件：37℃，5% CO2+95%空氣孵育箱內常規培養傳代。

1.2.2 皮下成瘤： 取對數生長期HCC827細胞，經胰酶消化后制成5×107/ml的單細胞懸液，于各組鼠前腋皮下注射200 μl。對照組每日胃飼生理鹽水 5 ml/d，嗎啡組胃飼含嗎啡(20 mg/kg)生理鹽水5 ml/d，厄洛替尼組胃飼含厄洛替尼(5 mg/kg)生理鹽水5 ml/d，嗎啡聯合厄洛替尼組胃飼含嗎啡(20 mg/kg)和厄洛替尼(5 mg/kg)生理鹽水 5 ml/d。實驗中裸鼠自由攝食飲水。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 腫瘤體積計算： 每周測量瘤體長徑(a)和瘤體短徑(b)，并計算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=ab2/2。

1.3.2 腫瘤細胞凋亡檢測： 實驗3周后處死裸鼠，分離新鮮腫瘤組織，部分用于磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，調整細胞數為1×106/ml，使用預先配制好的1×Binding Buffer 100 μl重懸細胞，按組別加入FITC Annexin Ⅴ 5 μl和PI染料5 μl震蕩混勻，室溫避光孵育15 min后加入1×Binding Buffer 400 μl混勻，流式細胞儀(FITC Annexin Ⅴ/PI雙染法)檢測各組細胞凋亡情況。Annexin Ⅴ-FITC陽性PI陰性細胞，代表早期凋亡率；Annexin Ⅴ-FITC陽性PI陽性細胞，代表晚期凋亡率。細胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.3.3 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達檢測： 上述剩余腫瘤組織標本用眼科剪剪碎后加入大約5倍體積的組織裂解液，用玻璃研磨器將組織塊研碎，冰上裂解30 min，4℃低溫離心機高速離心(13 000 r/min 20 min)，提取上清液即為總蛋白。采用BCA試劑盒進行蛋白定量后行Western blot實驗：抗Bax(1∶1 000)、Bcl 2(1∶500)、Caspase-3(1∶300)和抗GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TTBS洗膜3次，每次20 min，加入HRP標記的IgG(TTBS按1: 10 000稀釋)，37℃孵育1 h。TTBS避光洗膜3次，每次25 min，將ECL試劑盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，反應1 min后對Western blot條帶進行顯影，以目的條帶和GAPDH條帶的光密度值比值作為最終結果。

2 結 果

2.1 腫瘤體積比較 對照組腫瘤生長迅速，隨時間延長腫瘤體積明顯增大；嗎啡組腫瘤生長緩慢，體積相對減小，但與對照組相比差異無統計學意義(P=0.063)；厄洛替尼組及聯合組腫瘤生長更為緩慢，裸鼠腫瘤體積均明顯縮小，與對照組比較差異具有統計學意義(P=0.000)；與厄洛替尼組比較，聯合組變化不明顯(P=0.701)，見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.01

2.2 腫瘤細胞凋亡率比較 各組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(F=126.287，P<0.01)。與對照組(11.77±0.71)%比較，嗎啡組腫瘤細胞凋亡率(13.87±1.97)%雖有所增加，但差異無統計學意義 (P>0.05)，厄洛替尼組(35.73±2.78)%和聯合組腫瘤細胞凋亡率(37.17±2.39)%較對照組明顯增多 (t/P=20.455/<0.001,t/P=24.954/<0.001)；而厄洛替尼組與聯合組腫瘤細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(t=0.969,P=0.353)，見圖2、3。

圖2 FITC AnnexinⅤ/PI雙染法流式細胞術各組細胞凋亡圖

注:與對照組比較，aP<0.05

2.3 凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達比較 各組凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3比較，差異有統計學意義(F=101.555、161.308、96.757，P<0.001)。與對照組比較，嗎啡組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達均無統計學意義(P>0.05)，厄洛替尼組和聯合組Bcl-2表達減少，Bax和Caspase-3表達增加，差異均具有統計學意義(P=0.000)；厄洛替尼組與聯合組比較，Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖4、5。

圖4 各組凋亡相關蛋白的電泳圖

注：與對照組比較，P<0.001

3 討 論

隨著精準醫學概念的提出，EGFR基因突變的發現，EGFR-TKI類藥物如厄洛替尼的研發及臨床應用，為亞裔尤其是中國攜帶EGFR敏感突變的肺癌患者帶來了更長生存時間和更好的生活質量[1-2]。肺癌目前居惡性腫瘤發病和死亡首位，5年生存率依然差強人意[6-7]。隨著病情進展，大部分患者都會經歷癌痛的折磨，嚴重影響患者的治療和生活質量。依據“三階梯止痛”原則，嗎啡已被廣泛用于腫瘤患者癌痛的治療。但迄今為止，嗎啡等阿片類藥物與腫瘤細胞增殖和凋亡的具體機制仍不清楚[3-5，8]。

筆者前期研究發現，在細胞學水平嗎啡、厄洛替尼以及嗎啡聯合厄洛替尼作用于HCC827細胞后，均可引起HCC827細胞凋亡率增加[9]。在前期實驗的基礎上通過建立HCC827肺腺癌細胞裸鼠成瘤模型深入地研究嗎啡聯合厄洛替尼對腫瘤細胞的影響及其機制。

研究發現，嗎啡組腫瘤生長稍緩慢，與對照組比較差異無統計學意義。厄洛替尼組及嗎啡聯合厄洛替尼組腫瘤生長更為緩慢，與對照組比較腫瘤體積明顯縮小，差異有統計學意義(P<0.05)。與厄洛替尼組相比嗎啡聯合厄洛替尼組腫瘤體積無明顯差別。該結果表明嗎啡聯合厄洛替尼時，嗎啡并未影響厄洛替尼抗腫瘤及延緩腫瘤生長的作用。

凋亡作為細胞程序性細胞死亡方式，在維持機體細胞新生及代謝平衡方面起著至關重要的作用[10-11]。為進一步研究動物水平嗎啡聯合厄洛替尼抗腫瘤機制，進一步應用流式細胞學技術和Western blot技術檢測了細胞凋亡率和凋亡相關蛋白的表達。既往研究表明Bcl-2屬于原癌基因家族，可通過抑制Caspase-3的表達發揮抗凋亡效應[12]；敲除Bcl-2家族成員Bim可以引起內源性藥物抵抗或者降低腫瘤細胞EGFR-TKIs的敏感性而產生耐藥[13]，Bax基因下調亦會導致厄洛替尼誘導細胞凋亡效應減弱[14-17]。筆者前期研究也發現嗎啡作用于HCC827細胞可引起細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表達的變化[16]。

與對照組比較，嗎啡組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，差異無統計學意義，與前期細胞水平結果不相一致[18]。其原因分析可能與體內體外試驗因素有關，亦可能與嗎啡濃度有關。劉紅軍等[19]研究發現，嗎啡呈濃度依賴性的促進MADB-106乳腺癌細胞的凋亡。厄洛替尼組及嗎啡聯合厄洛替尼組細胞凋亡率明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達增加，且差異具有統計學意義(P<0.01)；與厄洛替尼組比較，嗎啡聯合厄洛替尼組在細胞凋亡率及凋亡相關蛋白的表達無明顯差別(P>0.05)。進一步說明厄洛替尼或嗎啡聯合厄洛替尼應用時可通過線粒體通路誘導細胞凋亡來發揮抗腫瘤效應。

嗎啡在緩解疼痛的同時并不會消弱厄洛替尼的抗腫瘤作用，本研究為嗎啡聯合厄洛替尼治療晚期非小細胞肺癌患者生活質量的提升提供了理論基礎，為嗎啡和厄洛替尼的臨床應用提供實驗依據。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

張雅靜：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;馬驂：提出研究思路，分析實驗數據;梁歡：實施研究過程，數據收集整理;相成：進行統計學分析;張燕：論文終審