黃芪甲苷對肥胖糖尿病大鼠腎臟氧化應激、Nrf2蛋白表達和胰島β細胞的影響

劉文，章尹崗，別志霞，解為慈，葉迎春

糖尿病(DM)是以高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征，糖尿病腎病(DN)是其常見慢性并發癥，發病機制復雜，涉及高血糖、氧化應激等多種因素，其中氧化應激是關鍵因素之一，其產生的過量活性氧(ROS)可激活細胞內多種信號通路，介導高糖對腎組織的損傷[1-2]。有研究指出[3]，核因子E2相關因子2(Nrf 2)-抗氧化反應元件(ARE)信號通路是細胞抗氧化反應的中樞調節者。黃芪甲苷(AS-IV)是從傳統中藥黃芪中提取分離主要活性成分皂苷的有效單體成分，在臨床試驗研究中證實其具有抗炎、抗纖維化、抗糖尿病、抗氧化應激、心臟保護等多種藥理作用[4]。有研究報道[5]，AS-IV可降低DM大鼠血糖水平，發揮抗氧化作用，減輕心肌損傷。但關于AS-IV對Nrf2-ARE信號通路的影響鮮有報道。本研究建立肥胖DM大鼠模型，觀察AS-IV對大鼠腎臟氧化應激損傷的保護作用及對腎臟Nrf2-ARE信號通路的影響，旨在進一步了解AS-IV對DM大鼠腎臟損傷的防止作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)實驗動物：健康雄性Wistar大鼠25只，購于重慶騰鑫華阜公司，周齡6～8周，實驗前為標準飼養，日常光照，自然飲水。(2)主要試劑 ： STZ(鏈脲佐菌素，美國Sigma公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(美國Omega公司)，總蛋白、核蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技公司)，兔抗Nrf 2多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗GAPDH單克隆抗體(美國CST公司)。(3)儀器設備：血糖分析儀(德國羅氏公司)、BH-2型光學顯微鏡(日本Olympus公司)、UVP分析儀(美國 BioSpec公司)。

1.2 模型建立與分組 2018年1—6月于武漢大學人民醫院動物實驗室進行實驗，適應性喂養1周后，隨機數字表法選取8只作為對照組，普通飼料喂養(碳水化合物65%，蛋白質25%，脂肪10%)；另外17只高脂飼料喂養(脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白質20%)，喂養2周后，給予STZ 60 mg/kg一次性單劑量腹腔注射，建立DM大鼠模型，注射72 h后鼠尾靜脈取血測血糖，將非禁食血糖>16.7 mmol/L，且能維持1周作為評價造模成功的標準，僅1只大鼠造模失敗，16只大鼠造模成功。再按隨機數字表法分為DM組及AS-IV組，各8只。AS-IV組給予80 mg·kg-1·d-1AS-IV灌胃給藥，對照組和DM組給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。連續給藥8周。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 標本收集： 給藥8周后處死大鼠，處死前將大鼠放入代謝籠，留取24 h尿液并記錄尿量，而后給予5%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，4℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清低溫-80℃冰箱保存；并于麻醉后剖腹取其腎臟，濾紙吸干血跡稱質量備用。部分腎皮質使用4%中性甲醛固定，石蠟包埋制片，行蘇木精—伊紅(HE)染色；剩余部分迅速放于液氮凍存，行Western免疫印跡試驗。

1.3.2 血、尿相關指標及體質量測定： 采用血糖分析儀檢測空腹血糖(FPG)，放射免疫法檢測空腹胰島素(FINS)，使用雙抗體夾心法檢測24h尿白蛋白排泄率(UAER)，并測定大鼠體質量。

1.3.3 腎臟氧化應激指標檢測： 上述腎臟組織生理鹽水沖洗干凈，剪碎后加入適量裂解液搖勻，采用南京建成生物公司生產的試劑盒檢測MDA、總超氧化物歧化酶(T-SOD)水平，嚴格按照說明書操作。

表1 各組大鼠血、尿相關指標及體質量比較

1.3.4 胰島細胞病理改變觀察： 大鼠胰尾組織常規固定、切片(厚度2 μm)，HE染色，在光學顯微鏡下觀察胰島細胞組織形態學、結構變化。胰島細胞凋亡：石蠟切片后，采用原味末端標記法(TUNEL)檢測，并在光學顯微鏡下觀察凋亡細胞，計算凋亡率(凋亡細胞核數目/總細胞核數目×100%)，具體操作嚴格按照說明書進行。

1.3.5 Western免疫印跡檢測Nrf 2蛋白： 取液氮凍存的腎皮質，充分研磨、裂解、離心，4℃ 1 200 r/min離心10 min，取上清液提取總蛋白，制膠，電泳，將蛋白轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經5%脫脂牛奶封閉，加入兔抗Nrf 2多克隆抗體(1∶800)及GAPDH標準內參(1∶1 000)，4℃孵育過夜后，加入相應的二抗，室溫下孵育1 h，加ECL顯色，使用美國UVP分析儀掃描膠片，得到灰度值。

2 結 果

2.1 血、尿相關指標及體質量比較 DM組及AS-IV組大鼠FPG、UAER及體質量顯著高于對照組，FINS顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)；AS-IV組大鼠FPG、UAER及體質量顯著低于DM組，FINS顯著高于DM組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

2.2 腎臟氧化應激指標比較 DM組及AS-IV組大鼠MDA含量顯著高于對照組，T-SOD活性顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)；AS-IV組大鼠MDA含量顯著低于DM組，T-SOD活性顯著高于DM組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

2.3 胰島細胞病理改變比較 對照組大鼠胰島輪廓清晰，胰島細胞數目較多且大小一致、排列整齊；DM組大鼠胰島輪廓不清，胰島細胞數目較對照組顯著減少，且出現腫脹、壞死及空泡變性，呈不規則排列；AS-IV組大鼠胰島輪廓較為清晰，胰島細胞數目較DM組有所增多，形態、排列較為規則，無明顯壞死(圖1見封3)。

表2 各組大鼠腎臟氧化應激指標比較

2.4 胰島細胞凋亡情況比較 光學顯微鏡下觀察凋亡的胰島細胞核染色質濃縮，呈棕黃色，而未凋亡的細胞核染色質呈藍色。TUNEL檢測結果發現，對照組棕黃色細胞核數目較少，DM組棕黃色細胞核數目較對照組顯著增多，AS-IV組棕黃色細胞核數目較DM組有所減少(圖2見封3)。DM組及AS-IV組大鼠胰島細胞凋亡率顯著高于對照組(t=9.991、5.987，P=0.000)，AS-IV組大鼠胰島細胞凋亡率顯著低于DM組，差異均有統計學意義(t=6.952，P=0.000)，見圖3。

注：與對照組比較，aP<0.01；與DM組比較，bP<0.01

2.5 Nrf 2蛋白表達 免疫印跡結果顯示，DM組大鼠腎組織總Nrf 2、核Nrf 2蛋白表達顯著低于對照組及AS-IV組(t=2.542、3.881、2.642、2.267，P=0.024、0.002、0.019、0.040)，AS-IV組大鼠腎組織總Nrf 2、核Nrf 2蛋白表達顯著高于DM組，差異均有統計學意義(t=2.985、2.928，P=0.010、0.011)，見圖4、5。

圖4 各組大鼠腎組織總Nrf2、核Nrf2蛋白表達

注：與對照組比較，aP<0.05；與DM組比較，bP<0.05

3 討 論

DM發病機制復雜，目前多認為是在遺傳基礎上多因素共同作用的結果。近年來，多項研究提示氧化應激反應中產生的ROS是引起DM發生、發展的關鍵因素，關于氧化應激反應的研究現已成為熱點領域[6]。DM患者腎臟易受氧化應激反應影響，損傷腎組織細胞，破壞基質重構，導致組織纖維化及信號通路異常，從而促進DN的發生發展，加重腎臟損傷。機體內過多的ROS可攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸，形成MDA等脂質過氧化物，干擾機體新陳代謝[7-8]。T-SOD是具有抗氧化作用的小分子肽類物質。本研究中DM組及AS-IV組大鼠MDA含量顯著高于對照組，T-SOD活性顯著低于對照組，AS-IV組大鼠MDA含量顯著低于DM組，T-SOD活性顯著低于DM組，提示高脂飲食可導致機體內大量ROS蓄積，營養過剩從而誘發氧化應激反應，而給予AS-IV治療可有效改善氧化應激反應，減輕腎臟損傷，與韓冬[9]研究類似。

AS-IV是以黃芪為原料的黃芪皂苷類單體成分，經藥理研究證實對人體多臟器、多系統具有較好的保護作用，抗炎、降壓、改善心肌缺血等方面作用顯著[10-11]。據統計，在治療糖尿病的處方中，黃芪使用率極高，從黃芪根中分離的多糖(APS-G)可雙向調節血糖，降低葡萄糖負荷的小鼠血糖水平，改善抗腎上腺素導致的小鼠血糖升高反應[12]。涂祎珺等[13]研究報道，黃芪可有效提高血漿白蛋白水平，降低尿蛋白排出量，提供機體必需氨基酸，顯著改善腎小球疾病導致的代謝紊亂，同時黃芪強大的降脂效果還可以防治腎小球硬化。肖峰等[14]研究發現，黃芪可有效抑制DM大鼠早期腎/體質量增加，降低大鼠高血糖。尚偉慶[15]采用中西醫結合方法治療腎病綜合征患者的研究提示，黃芪可提高血漿白蛋白水平，降低24h尿蛋白定量，且AS-IV可促進H3亮氨酸合成肝臟蛋白，加速蛋白質合成。本研究DM組及AS-IV組大鼠FPG、UAER及體質量顯著高于對照組，FINS顯著低于對照組，AS-IV組大鼠FPG、UAER及體質量顯著低于DM組，FINS顯著高于DM組，與上述研究較為一致，認為AS-IV可有效改善DM大鼠血糖，減輕體質量，降低尿白蛋白排泄量，改善腎小球肥大及基質增生，從而發揮腎臟保護作用。

Nrf2是調節機體氧化應激反應的重要因子，正常情況下，可在機體各組織及細胞中表達，與Kelch樣環氧丙烷相關蛋1(Keap1)結合形成二聚體在胞漿中存在，最后被泛素化降解，僅小部分穩定Nrf2可經磷酸化轉位進入細胞核。并與ARE作用激活Nrf2-ARE通路，使Nrf2下游靶基因(抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因)維持在基礎表達水平，細胞趨于穩定狀態。但氧化應激反應產生的ROS可使Nrf2磷酸化并與Keap1解離，轉位入細胞核與ARE結合，激活Nrf2下游靶基因轉錄表達。Peng等[16]動物研究發現敲除大鼠Nrf2基因的氧化應激反應發生率更高，Nrf2基因缺失或激活障礙的大鼠氧化應激源細胞毒性更強，分析其原因學者們認為與慢性炎性反應及細胞凋亡相關。因而，可認為Nrf2-ARE通路對機體氧化應激反應、炎性反應及凋亡過程中具有較好的保護作用。

本研究Western免疫印跡結果顯示，DM組、AS-IV組大鼠腎組織總Nrf2、核Nrf2蛋白表達顯著低于對照組，AS-IV組大鼠腎組織總Nrf2、核Nrf2蛋白表達顯著高于DM組，與前面提到的Nrf2-ARE通路的抗氧化應激、抗炎性反應作用相符。Vento等[17]研究發現，當ROS表達上調并超過Nrf2的抗氧化能力后，可提高Nrf2降解作用，降低Nrf2活性，從而導致嚴重的氧化應激損傷。基于此，筆者認為本研究DM組大鼠總Nrf2、核Nrf2蛋白低表達的原因可能是由于高糖高脂飲食下，ROS過多生成并蓄積，直接抑制Nrf2，導致其胞漿泛素化降解程度增加，入核減少，總蛋白、核蛋白均為低表達。而胰島β細胞抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因均為低表達，抗氧化應激及炎性反應作用較差[18-20]，DM組Nrf2蛋白低表達，可進一步減弱抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因在胰島β細胞中的表達，從而加重胰島β細胞氧化應激損傷及炎性反應損傷。而AS-IV組總Nrf2、核Nrf2蛋白表達顯著高于DM組，提示應用黃芪甲苷可激活Nrf2-ARE通路，減輕Nrf2泛素化降解程度，穩定其胞漿濃度，提高核轉移活性，并上調抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因的表達，從而提高對胰島β細胞的保護作用，延緩胰島β細胞凋亡。

綜上所述，AS-IV有降低肥胖DM大鼠血糖、體質量，減少尿蛋白排泄的作用，同時還能減輕大鼠腎臟氧化應激反應，上調Nrf2蛋白表達，激活Nrf2-ARE通路，從而起到防止胰島β細胞進一步損傷的作用。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

劉文：設計研究方案，起草及修訂論文；章尹崗、別志霞：資料搜集整理；解為慈、葉迎春：實施研究過程，收集和分析數據，論文審核