HOXB7 在特發性肺纖維化中抗纖維化的作用

周淼 李風雷 張海龍 孫俊波

1河南中醫藥大學第三附屬醫院肺病科（鄭州450000）；2河南中醫藥大學第一臨床醫學院（鄭州450000）；3河南中醫藥大學第二附屬醫院中醫內科（鄭州450000）

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種進行性纖維化的間質性肺炎，發病率高，藥物治療手段有限，預后不良［1］。主要病理特點是Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，成纖維細胞積聚和肺實質異常重塑［2］。上皮細胞-間充質轉化（EMT）是器官纖維化局灶成纖維細胞的重要來源，有研究表明Ⅱ型肺泡上皮細胞可通過EMT 轉化為成纖維細胞，從而參與肺纖維化的病理過程［3-4］。

同源盒基因HOXB7 屬于HOX 基因家族B 簇，與腫瘤發生發展關系密切［5］。HOXB7 高表達可促進EMT［6］，還沒有相關報道證實其在IPF 中Ⅱ型肺泡上皮細胞EMT 中的作用。因此，本研究檢測HOXB7 對Ⅱ型肺泡上皮細胞EMT 的作用，首次揭示其在IPF 中扮演的角色及可能的調控機制。另外，有研究表明堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對EMT 有調節作用且可被HOXB7 調控［7］，因此筆者假設HOXB7 可通過調節bFGF 來調節Ⅱ型肺泡上皮細胞EMT 過程，從而調控IPF 的發生、發展。

1 材料與方法

1.1 材料 A549 細胞購自美國ATCC 公司；胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素和DMEM 購自美國HyClone 公司；SYBR Premix Ex Taq II 和TRIZOL購自大連寶生物工程有限公司；HOXB7 鼠單抗、bFGF 鼠單抗、E-cadherin 鼠單抗、α-SMA 鼠單抗、COL1A1 鼠單抗、TGF-β1 鼠單抗、GAPDH 鼠單抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗購自美國Cell Signaling Technology 公司；BCA 試劑盒購自美國Pierce 公司；Turbofect 購自賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染后形態學觀察 人Ⅱ型肺泡上皮細胞A549 由含10% FBS，2 mmol∕L L-glutamine，100 U∕mL 青霉素和100 μg∕mL 鏈霉素的低糖DMEM 培養基于5%CO2、37 ℃條件下培養，細胞融合度達90%傳代。傳代后細胞生長至70%用無血清培養基培養24 h 使之同步化。隨后進行TGF-β1誘導細胞EMT 過程（將TGF-β1 以5 ng∕mL 的 濃度稀釋于含0.1% BSA 的無血清DMEM 培養基培養48 h）或細胞轉染。細胞分組如下：空白對照（Control組）、TGF-β1 誘導（TGF-β1組）、TGF-β1 誘導48 h 后轉染HOXB7 siRNA（β1-HOXB7 si組）、TGF-β1 誘導48 h 后轉染non-specific siRNA（β1-non-spe組）。最后，使用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態改變。

1.2.2 組織采集 6例IPF 患者肺組織作為IPF組，其中男5 例，女1 例，年齡45～67 歲，平均58 歲。另外，對照組為因肺部病變行肺葉切除術，肺標本取自遠離病變部位，其中男3 例，女3 例；年齡47～60 歲，平均55 歲。組織立即冷凍。標本均由河南中醫藥大學第三附屬醫院提供，患者簽署了知情同意書。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測［8］TRizol 提取細胞或組織總RNA，利用反轉錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA，而后以cDNA為模板進行qRT-PCR。反應程序：95 ℃4 min；95 ℃10 s，59 ℃30 s，共40 個循環；72 ℃10 min。HOXB7 引物：Sense primer：5′-AAGTTCGGTTTTCGCTCCAGG-3′；Anti-sense primer：5′-ACACCCCGGAGAGGTTCTG-3′。E-cadherin 引物：Sense primer：5′-TTCTTCGGAGGAGAGCGG-3′；Anti-sense primer：5′-CAATTTCATCGGGATTGGC-3′。α-SMA 引物：Sense primer：5′-CTATGCCTCTGGACGCACAAC-3′；Anti-sense primer：5′ - CCCATCAGGCAACTCGTAACTC - 3′ 。COL1A1 引物：Sense primer：5′-AACGAGATCGAG CTCAGAGG -3′；Anti-sense primer：5′-GGGAGG TCTTGGTGGTTTTG-3′。GAPDH引物：Sense primer：5′-CGTCTTCACCACCATGGAGA- 3′ ；Anti-sense primer：5′-CGGCCATCACGCCACAGTTT-3′。反應體系20 μL，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ。GAPDH 為內參，2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

1.2.4 免疫印記（Western blot） 收集細胞，裂解提取蛋白質，BCA 試劑盒測定濃度且取25 μg 蛋白質進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉法將蛋白質轉移至PVDF 膜。5%脫脂奶粉的Tris Buffered Saline With Tween 溶液室溫封閉膜2.5 h，一抗：HOXB7 鼠單抗（1∶800）、bFGF 鼠單抗（1∶700）、E-cadherin 鼠單抗（1∶500）、α-SMA 鼠單抗（1∶500）、COL1A1 鼠單抗（1∶500）、TGF-β1 鼠單抗（1∶700）和GAPDH 鼠單抗（1∶1 000）4 ℃過夜。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，暗室曝光觀察結果。GAPDH 為內參對照蛋白。

1.2.5 細胞轉染 將A549（3 × 105）接種于6 孔板，37 ℃，5%CO2條件下培養24 h，參照Turbofect操作說明進行轉染，將HOXB7 siRNA（5′-GCUAUU GUAAGGUCUUUGUTT-3′，5 μg）、non-specific siRNA（5 μg）分別與6 μL Turbofect 混合，分別加入各孔中。5%CO2條件下轉染48 h，后利用qRT-PCR和Western blot 方法檢測轉染效率。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 進行統計學分析，數值均采用均數±標準差表示。兩組均數間比較采用t檢驗，多組之間采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 纖維化組織中HOXB7 表達量升高 為研究纖維化對HOXB7 表達量的影響，利用qRT-PCR 檢測纖維化組織HOXB7 的mRNA 表達量。結果表明，纖維化組織HOXB7 mRNA（圖1）的表達量是正常組織的2 倍，差異具有統計學意義。

圖1 特發性肺纖維化對HOXB7 表達量的影響Fig.1 The effect of IPF on HOXB7 expression

2.2 抑制HOXB7 表達量 為探究HOXB7 對細胞纖維化的作用，首先通過細胞轉染HOXB7 siRNA抑制HOXB7，qRT-PCR 和Western blot 分別檢測細胞轉染后A549 中HOXB7 mRNA 和蛋白表達量的變化。結果表明，β1-HOXB7 si組HOXB7 mRNA（圖2A）和蛋白表達量（圖2B）較β1-non-spe組顯著下調。

2.3 下調HOXB7 抑制細胞纖維化 在HOXB7 抑制的情況下，通過倒置相差顯微鏡觀察HOXB7 對A549 細胞纖維化的影響。結果表明，TGF-β1組細胞形態與control組相比，細胞由鵝卵石形或多角形轉變為梭形、細胞間連接變松散，呈間充質細胞形態。而β1-HOXB7 si組細胞形態又轉變為鵝卵石形或多角形與control組相同（圖3）。

圖2 轉染后A549 中HOXB7 的表達量變化Fig.2 The change of HOXB7 expression in A549 aftertransfection

圖3 轉染后A549 形態學變化（×200）Fig.3 Morphological change of A549 after transfection

2.4 下調HOXB7 抑制細胞EMT 過程 為進一步證實HOXB7 對A549 細胞纖維化的作用，檢測了抑制HOXB7 對A549 EMT 的標志物分子E-cad、α-SMA 和纖維化標志物COL1A1 表達量的影響。結果顯示，與β1-non-spe組相比，β1-HOXB7 si組中，E-cadherin的表達量顯著升高，α-SMA 和COL1A1的表達顯著降低（圖4）。

2.5 HOXB7 通過調節bFGF 來調控細胞EMT為探究HOXB7 對細胞纖維化調控的可能機制，利用Western blot 檢測bFGF 蛋白表達量。結果表明，β1-HOXB7 si組中bFGF 的蛋白表達量較β1-non-spe組顯著降低（圖5A）。為了探究HOXB7 對A549 細胞纖維化的調控作用是否可以通過調控bFGF 來實現，用bFGF（9 ng∕mL）孵育β1-HOXB7 si組細胞5 min，發現E-cadherin 蛋白表達量明顯降低，α-SMA 和COL1A1 的蛋白表達量均顯著升高（圖5B）。

圖4 轉染后A549 中EMT 標志物和COL1A1 的表達量變化Fig.4 Changes in expression levels of EMT markers and COL1A1 in A549 after transfection

3 討論

IPF 是彌漫性間質性肺病中的特殊類型，無特效治療方法，嚴重威脅人類健康。IPF 共同特點是大量成纖維細胞∕肌成纖維細胞聚集和細胞外基質積聚［9］。成纖維細胞和肌成纖維細胞聚集是肺纖維化重要環節，肌成纖維細胞激活可分泌Ⅰ和Ⅱ膠原蛋白，同時促進α-SMA 的表達［10-11］。Ⅱ型肺泡上皮細胞可通過EMT 轉化成肺成纖維細胞∕肌成纖維細胞［12］。在EMT 過程中，上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞并獲得遷移能力，上皮細胞標記物E-cadherin 等表達下調，間葉標記物α-SMA 等表達上調［13］。因此，本研究選擇E-cadherin 作為上皮細胞標記物，α-SMA 為間葉標記物，可以有效評價EMT 的轉化。Ⅰ型膠原蛋白（COL1A1）的表達也是纖維化的標志［14］。本研究通過檢測Ⅱ型肺泡上皮細胞A549 的EMT 轉化，來評定HOXB7 對肺纖維化的作用。

圖5 bFGF 對A549 中EMT 的影響Fig.5 Effect of bFGF on EMT in A549

HOXB7 是胚胎發育時期調控上皮包括肺上皮細胞增殖、分化、遷移的主控基因，而在成體時期，HOXB7 高表達可促進上皮細胞惡性轉化［15］。研究表明，HOXB7 的高表達促進結腸癌、口腔癌、黑色素和肺腺癌等多種癌癥細胞的增殖和EMT［16］。HUAN 等［17］發現，HOXB7 通過誘導細胞EMT 轉化促進乳腺癌細胞遷移。YANG 等［6］發現，HOXB7促進骨肉瘤細胞EMT，從而促進骨肉瘤細胞的增殖和轉移。STIEGELBAUER 等［5］報道HOXB7 被miR-196b-5p 抑制后，結腸癌細胞EMT 同樣被抑制，從而降低結腸癌細胞轉移。然而，對于HOXB7是否對肺纖維化過程中EMT 有影響，目前為止還沒有相關報道。SHIMBORI 等［18］表明，TGF-β1 可顯著誘導A549 細胞纖維化。本研究發現，IPF組織HOXB7 的表達量顯著升高。降低HOXB7 表達量有效抑制TGF-β1 誘導的A549 形態上纖維化轉變且抑制EMT 和COL1A1 的表達，說明A549 纖維化被抑制。因此，本研究首次發現HOXB7 在IPF組織中表達量上調，且干擾HOXB7 表達可抑制TGF-β1 誘導的體外培養A549 細胞的纖維化。為IPF 的預防和治療提供了一定的理論基礎，但本研究側重于對體外培養細胞的研究，所以在后續的實驗中可以側重于體內研究。

有研究［19］表明在口腔癌和乳腺癌細胞中，HOXB7調控bFGF，進而影響癌癥發生、發展。bFGF具有促進EMT 的作用，如在晶狀體上皮細胞、肝細胞癌細胞、前列腺癌細胞中等［7，20］。因此，筆者假設HOXB7 通過調控bFGF 影響A549 細胞纖維化。本研究，結果表明在TGF-β1 誘導細胞的情況下，降低HOXB7 顯著抑制bFGF 表達量，且bFGF 孵育上述抑制HOXB7 的A549 后，顯著消除了抑制HOXB7 對細胞EMT 的作用。因此，減少HOXB7 表達量對TGF-β1 誘導的A549 細胞纖維化的抑制作用，可通過調控bFGF 來實現。

綜上，本研究發現IPF組織中HOXB7 表達量顯著上升，降低HOXB7 顯著抑制TGF-β1 誘導的A549 細胞形態學上纖維化的變化，且抑制EMT 和COL1A1 表達。另外。降低HOXB7 可抑制bFGF的表達，且通過調控bFGF 來抑制TGF-β1 誘導的A549 細胞纖維化，為IPF 的防治提供新的潛在靶標和理論基礎。