高糖誘導H9c2 心肌細胞TRAP1 的表達變化及意義

鐘禎 李萬根 張霄旦

廣州醫科大學附屬第二醫院內分泌科（廣州510260）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是常見的糖尿病心血管并發癥之一，是一種獨立于高血壓、冠心病的特異性心臟疾病，1972年被RUBLER 等［1］首次發現并報道。DCM 增加糖尿病患者心力衰竭的風險，是糖尿病患者死亡的主要原因之一［2］。DCM的發生、發展是多因素的，但高血糖環境下心肌細胞線粒體電子傳遞鏈產生超氧化物（reactive oxygen species，ROS）引起的氧化應激被認為是導致DCM 的共同途徑［3］。ROS 可以誘導線粒體通透性轉運孔的開放，釋放出細胞色素C等活性物質，影響線粒體膜內外電荷分布，降低線粒體膜電位，導致線粒體功能障礙。腫瘤壞死因子相關受體蛋白1（tumor necrosis factor receptorassociated protein 1，TRAP1）是一種定位于線粒體的熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）家族成員，具有抗氧化活性，在某些應激或病理條件下線粒體穩態維持中起重要作用［4］。TRAP1 可通過抑制ROS 的產生減輕氧化應激從而保護細胞，減少細胞凋亡。目前對于TRAP1 的研究主要集中在腫瘤領域，被認為是線粒體功能的關鍵調控因子，有助于腫瘤細胞逃避死亡損傷［5-6］。目前TRAP1 在DCM 的研究尚未見報道，相關機制尚不明確。

本研究通過檢測高糖環境下心肌細胞線粒體功能改變、心肌細胞活性變化以及高糖作用下心肌細胞TRAP1 表達。首次探討了DCM 發生發展過程中TRAP1 的表達變化及作用，為尋找新的治療靶點提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 大鼠心肌細胞株H9c2 購自中科院上海細胞保藏庫；低糖DMEM 培養基、胎牛血清購于美國GIBCO 公司；D-Glucose、D-Mannitol 購于Sigma 公司；PrimeScriptTMRT Master Mix 轉染試劑購于美國Takara 公司；Applied BiosystemsTMPowerUpTMSYBRTMGreen Mix、Trizol 購于美國Invitrogen公司；兔抗大鼠TRAP1 多克隆抗體購于美國Abcam 公司；HRP 標記的羊抗兔二抗購于美國Genecopoeia 公 司；CellTiter 96?AQueous One Solution Assay（MTS）購于美國Promega 公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購于碧云天。

1.2 H9c2 細胞的培養及分組 大鼠心肌H9c2 細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的低糖DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，細胞密度達到70%～80%時1∶3 傳代，生長對數期細胞用于實驗。實驗分為3組：正常糖對照組（C）：含5.5 mmol∕L 葡 萄 糖 的DMEM 培 養 基 處 理 細 胞48 h；高糖組（G）：含33.0 mmol∕L 葡萄糖的DMEM培養基處理細胞48 h；高滲組（M）：含5.5 mmol∕L葡 萄 糖+27.5 mmol∕L 甘 露醇 的DMEM 培 養 基處 理細胞48 h。

1.3 Western blot H9c2 細胞以1.5×105個∕孔的密度接種于六孔板中，培養12 h 貼壁，予不同葡萄糖濃度或甘露醇處理48 h 后，各組細胞加預冷的PBS 洗兩遍，加入蛋白裂解液，冰浴10 min 后將細胞從孔板中刮取下來，超聲破碎細胞后離心，取上清，采用BCA 法進行蛋白定量。加入5×Loading Buffer 后煮沸10 min，經10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，轉移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應抗體4 ℃過夜。一抗工作濃度為TRAP1（1∶1 000），加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h，加入發光液后放入化學發光成像分析儀中曝光。Image J 分析軟件分析各條帶灰度值，以檢測蛋白條帶灰度值與內參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白表達情況。

1.4 qRT-PCR H9c2 細胞以1.5 × 105個∕孔的密度接種于六孔板中，培養12 h 貼壁，予不同葡萄糖濃度或甘露醇處理48 h 后，每孔加入1 mL Trizol提取總RNA，用酶標儀測定RNA 樣本純度及濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將總RNA 逆轉錄成cDNA，反應體系30 μL。以逆轉錄所得cDNA 為模板，每個樣本設置3 個目的基因及3 個內參基因平行試驗，應用LightCycler?480 進行實時PCR 熒光定量檢測。目的基因mRNA 表達水平以2-ΔΔCT相對定量方法進行分析。引物：TRAP1-F：5′-CTCAGTTGCTACAGCCCACA-3′；TRAP1-R：5′-CTGCTATCATGGCGTTCTCA-3′；GAPDH-F：5-AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′；GAPDH-R：5-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.5 MTS 檢測細胞活性 H9c2 細胞以5 000 個∕孔接種于96 孔板，按各組細胞處理方法處理相應時間后，更換完全培養基100 μL ∕孔，每孔加入MTS 檢測試劑20 μL，輕輕搖勻，37 ℃孵育2 h，多功能酶標儀于490 nm 波長檢測各孔吸光度。

1.6 細胞內ROS 檢測 以2′，7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鹽（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）為熒光探針檢測，嚴格按照試劑說明書操作，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光強度，以綠色熒光強度反映細胞內ROS 水平，拍攝熒光圖。Image J 分析軟件對各組熒光圖進行熒光半定量，以IntDen∕Area 的值表示細胞平均熒光強度。

1.7 線粒體膜電位測定 運用JC-1 熒光染色檢測心肌細胞線粒體膜電位變化，嚴格按照說明書操作，熒光倒置顯微鏡下觀察紅色熒光強度，以紅色熒光強度反映細胞內線粒體膜電位水平拍攝熒光圖。Image J 分析軟件對各組熒光圖進行熒光半定量，以IntDen∕Area 的值表示細胞平均熒光強度。

1.8 統計學方法 采用SPSS 16.0 統計軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖環境下H9c2 細胞低表達TRAP1 高糖組TRAP1 蛋白表達量較正常糖對照組及高滲組均減少（P＜0.05），而高滲組與正常對照組相比，TRAP1 蛋白表達量差異無統計學意義。見圖1。高糖組TRAP1 mRNA 表達水平較正常糖對照組及高滲組均下降（P＜0.05），高滲組與正常糖對照組之間差異無統計學意義。見圖2。

圖1 高糖環境下H9c2 細胞TRAP1 蛋白表達情況Fig.1 Detection of protein expression of TRAP1 in H9c2 cells under hyperglycemia via Western blotting assays

2.2 高糖環境下H9c2 活性下降 高糖組心肌細胞活性低于對照組（P＜0.05），高滲組與正常糖對照組細胞活性差異無統計學意義。見圖3。

2.3 高糖環境下H9c2 生成ROS 增多 高糖組綠色熒光強度較正常糖對照組及高滲組高（P＜0.05），而高滲組綠色熒光強度與正常糖對照組差異無統計學意義。見圖4、5。

2.4 高糖環境下H9c2 細胞線粒體膜電位下降高糖組紅色熒光強度較正常糖對照組及高滲組高（P＜0.05），而高滲組紅色熒光強度與正常糖對照組差異無統計學意義。見圖6、7。

圖2 高糖環境下H9c2 細胞TRAP1 mRNA 表達情況Fig.2 Detection of mRNA expression of TRAP1 in H9c2 cells under hyperglycemia via RT-PCR

圖3 高糖環境下H9c2 細胞活性統計分析圖Fig.3 Detection of activity of H9c2 cells under hyperglycemia via MTS

圖4 各組細胞加載DCFH-DA 熒光探針后顯色，熒光倒置顯微鏡拍攝熒光圖Fig.4 Detection of of H9c2 cells under hyperglycemia via DCFH-DC

3 討論

糖尿病心血管并發癥是糖尿病患者致死的主要原因，DCM 早期階段表現為舒張功能障礙，后期表現為獨立于血脂異常、高血壓和冠狀動脈疾病的心力衰竭。胰島素抵抗、高胰島素血癥和高血糖是DCM 發展的獨立危險因素［7］。DCM 的發病機制主要包括全身代謝紊亂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統的異常激活、氧化應激、炎癥和功能失調性免疫調節等［8］。這些異常共同促進心臟纖維化，由無癥狀的心臟舒張功能障礙進展為心室順應性下降、收縮功能障礙，導致臨床心力衰竭。其中，氧化應激被認為是DCM 發生發展的始動因素。DCM 時氧化應激增強，ROS 生成增加，過氧化氫增加，同時過氧化氫酶活性下降［9］。高血糖及波動的血糖水平可誘發急性的氧化應激，細胞內氧化應激-抗氧化應激平衡失調，ROS 和活性氮生成過多和清除不足，過量ROS 在細胞內蓄積，可以誘導線粒體通透性轉運孔的開放，釋放出細胞色素C 等活性物質，影響線粒體膜內外電荷的分布，使線粒體膜電位降低，引起細胞功能障礙及細胞凋亡［10-11］。

圖5 各組綠色熒光圖熒光半定量統計分析圖Fig.5 Green fluorescence semi-quantitative statistical analysis

圖6 各組細胞加載JC-1 熒光探針后顯色，熒光倒置顯微鏡拍攝熒光圖Fig.6 Detection of mitochondrial membrane potential of H9c2 cells under hyperglycemia via DCFH-DC

圖7 各組紅色熒光圖熒光半定量統計分析圖Fig.7 Red fluorescence semi-quantitative statistical analysis

TRAP1 最早是通過酵母的雙雜交篩選鑒定，作為與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）的胞內結構域結合的新蛋白質被發現。與此同時，另一次的篩選發現TRAP1 和HSP90 蛋白家族成員之間具有34%的序列同一性和60%同源性，證明其是HSP90 家族的新成員，具有熱休克蛋白家族的一般性質，參與細胞蛋白修飾等生理過程［12］。TIAN 等［13］研究發現，敲低體外食管癌細胞系ECA109 和EC9706 中的TRAP1 表達可誘導ROS 和線粒體去極化的增加，使得細胞周期阻滯于G2∕M期，抑制細胞增殖，重新表達TRAP1可恢復細胞增殖和細胞凋亡。IM 等［14］用鐵螯合劑去鐵胺處理正常人肝細胞系Chang 細胞，觀察到細胞TRAP1 表達減少，同時ROS 的產生增加。過表達TRAP1 可減弱去鐵胺的作用，減少了ROS 的產生。這些結果表明，TRAP1 可通過減少ROS 產生而在保護線粒體免受破壞性刺激中起作用。

TRAP1 對心肌細胞也存在保護作用。近年來研究發現，TRAP1 可通過阻斷TAK∕P38、JNK 和AKT 等信號通路來減輕由壓力負荷引起的心肌肥大和心肌纖維化［15］。低氧環境可誘導心肌細胞中TRAP1 的表達增加，且TRAP1 蛋白可通過調節線粒體通透性轉換孔的開放對缺氧心肌細胞起到保護作用［16］。VOLOBOUEVA 等［17］用不含葡萄糖的培養基培養原代星形膠質細胞，發現細胞的TRAP1 表達量增高，同時TRAP1 的過表達可減少葡萄糖糖剝奪的星形膠質細胞中ROS 的產生和維持細胞線粒體膜電位。本研究利用高糖處理H9c2 細胞，觀察到高糖環境下細胞中TRAP1 的表達量較正常糖對照組及高滲組均下降，高滲對照組排除了高糖環境下滲透壓升高的影響，提示高糖毒性可引起心肌細胞TRAP1 表達下降。同時，筆者觀察到高糖環境下ROS 表達量較正常糖環境下和高滲透壓環境下均有所增加。對細胞線粒體功能及細胞損傷的檢測顯示高糖環境下細胞線粒體膜電位降低，線粒體功能受損，細胞活性下降。提示高糖毒性可通過增加ROS 的產生，影響線粒體功能，進而影響心肌細胞活性，造成心肌損傷。而TRAP1 表達的下降可增加細胞內ROS 含量，從而影響細胞線粒體功能，可能與高糖環境下ROS所致的線粒體功能受損所致的心肌損傷密切相關。

綜上所述，高糖環境下心肌細胞中TRAP1 蛋白表達的下降，參與到ROS 增加介導的心肌線粒體功能改變所致的糖尿病心肌病變中，但其中具體機制通路尚未明確，下一步需完善相關研究，為DCM 治療新方法提供理論依據。