液相芯片系統在檢測抗核抗體譜中的應用

張 程，吳姍姍，呂 丹

(遼寧中醫藥大學附屬醫院檢驗科,遼寧沈陽 110032)

抗核抗體是以真核細胞核內的DNA、RNA、蛋白或這些物質的分子復合物產生的自身抗體。按其核內各個分子的性能不同可將各抗核抗體區分開來，如抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)、抗組蛋白抗體、抗核仁抗體等。目前，抗核抗體靶抗原的分布已由傳統的細胞核成分擴散至整個細胞，細胞質、細胞膜等結構均可成為自身免疫系統的目標抗原，無器官特異度和種屬特異度[1]。抗核抗體可特征性地出現在自身免疫性疾病中，對疾病的活動性及預后、治療反應均具有一定的臨床意義[2]。現有的檢測自身免疫性疾病的方法主要有間接免疫熒光法(IFA)、線性免疫印跡法(LIA)等[3]，而這些方法存在需要血清量大、費時費力等缺點[4]。近年來，液相芯片技術已得到廣泛應用，包括對可提取核抗體的檢測均得到了認可[5]。該法提供了一種快速而靈敏的技術手段，通過對單一微球表面進行多種抗原的包被而實現相應抗體的同時檢測，達到快速、靈敏的目的[2]。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院收治的已確診為自身免疫性疾病患者120例，其中男45例，女75例。選擇健康對照組血清90例。研究對象均已簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 AtheNA Multi-Lyte自身抗體檢測試劑盒由美國宙斯公司提供。

1.3檢測方法 液相芯片(AtheNA法)可半定量檢測的抗體包括Ro52、SSA、SSB等15種。比對方法包括IFA法和LIA法。3種檢測方法均嚴格按試劑盒說明書要求進行操作。IFA法以任一核型滴度>1∶100為陽性標準，LIA法和AtheNA法以檢測抗核抗體譜中任一種抗體陽性為陽性標準。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件對數據進行學分析，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗；采用kappa一致性檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13種檢測方法陽性率比較 病例組AtheNA法、IFA法和LIA法檢測陽性率分別為61.7%、71.7%和50.8%;健康對照組分別為6.7%、5.6%和5.6%，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2AtheNA法與LIA法檢測15種抗體結果比較 除抗dsDNA抗體外，AtheNA法總符合率超過85.0%。2種檢測方法檢測抗dsDNA抗體具有高度一致性，其他14種抗體檢測結果一致性極佳。表明AtheNA法具有較高的靈敏度。見表2。

表1 3種檢測方法陽性率比較[n(%)]

2.3交叉反應驗證及標準曲線 1種微球僅針對其待測抗原發出高強度熒光，導致該種抗原只與其對應的抗體結合而并不與其他蛋白標志物結合，因此，抗體之間無交叉反應存在。由于目前缺乏抗核抗體譜抗體的國際校準品，所以無法通過聯合檢測的標準曲線去溯源，但AtheNA法可通過攜帶抗體的微球數來半定量反應抗體水平，而LIA法無法實現，所以，與LIA法比較，AtheNA法能實現半定量檢測，提高靈敏度，滿足臨床檢測需求。

表2 AtheNA法與LIA法檢測15種抗體結果比較

3 討 論

抗核抗體檢測對自身免疫性疾病的診斷已有50多年的歷史，尤其診斷系統性紅斑狼瘡的靈敏度幾乎達100%，抗核抗體陽性對系統性紅斑狼瘡的預測也具有較為重要的作用[6-8]。目前，常用的有免疫擴散法、酶聯免疫吸附法、免疫印跡法、液相芯片法和LIA法。隨著抗原提純技術的提高，LIA法、免疫印跡法和液相芯片法被越來越多的實驗室所采用。

液相芯片是新一代高通量生物芯片技術，因其具有高精準、特異性強等優勢可同時綜合分析多種標志物，在自身免疫、腫瘤篩查等方面體現出較高的診斷價值。傳統的“金標準”酶聯免疫吸附試驗雖然靈敏度較高，但每一反應孔只能檢測一種抗體，當多種抗體同時檢測就變得繁瑣、費時，AtheNA法的優點：(1)高通量。液相芯片可同時檢測100種生物標志物，可通過重組蛋白不斷更新自身抗體譜來建立診斷體系。(2)用血量少。(3)操作簡便。液相芯片采用熒光分析方法，活性范圍大大增強，節省了洗滌和稀釋的時間，使實驗時間大大縮短。

有研究結果表明，由于IFA法的基質為HEP-2/猴肝細胞，細胞結構較為完整，可幾乎完全捕獲待測血清中的抗核抗體，使其檢測抗核抗體陽性率較高[9]，但其僅為定性實驗，對臨床“灰區”患者不能確切說明問題。液相芯片技術是一種以經過特殊編碼、可識別的微球作為生物分子(抗原、抗體、蛋白質、核酸等)反應及信號檢測載體的陣列分析技術。微球逐一通過檢測通道時受到雙色激光的照射，既可識別微球表面包被的分子種類；又可確定目標分子數量，所以，可半定量確定抗體的水平，達到實現高精準的目的[10-12]。

本研究以LIA法作為參照，采用AtheNA法對15種抗核抗體進行了檢測，結果顯示，2種方法具有較高的一致性。LIA法因其各模塊上抗原濃度不詳，不可根據顯色條帶的深淺度來判斷待測抗體的水平[13-15]。而液相芯片通過每個微孔板中的大量微球，再配合不同激光的發射，可較精確地區別抗體，并實現待測抗體的半定量檢測[16-18]。

4 結 論

液相芯片系統對抗核抗體的聯合檢測具有良好的性能，其對抗核抗體譜的檢測具有較好的靈敏度和特異度。