3種肌酐測(cè)定方法的分析性能評(píng)價(jià)

王美珠，康 偉，黃勤烽，陳 敏

(福州總醫(yī)院檢驗(yàn)科/全軍檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，福建福州 350025)

肌酐是肌酸代謝終產(chǎn)物,人體每天的肌酐生成量相當(dāng)恒定，血中肌酐水平取決于腎小球?yàn)V過功能，測(cè)定肌酐水平可作為腎小球?yàn)V過率受損的指標(biāo)[1]。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)肌酐常用的方法主要有苦味酸法和肌氨酸氧化酶法(簡(jiǎn)稱氧化酶法)[2-3]，近年來，出現(xiàn)的另一種酶學(xué)檢測(cè)方法即亞胺水解酶法(簡(jiǎn)稱紫外酶法)，逐漸為臨床使用[4]。為比較其性能特點(diǎn)，本研究對(duì)上述3種肌酐檢測(cè)方法的精密度、線性范圍、可報(bào)告范圍、方法學(xué)比對(duì)、藥物干擾及開瓶穩(wěn)定性等分析性能指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集無溶血、黃疸和脂血的本院收治的患者及健康體檢者的新鮮臨床標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 氧化酶法和苦味酸法采用羅氏cobas 8000 c702全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑(批號(hào)：620823、617455)和校準(zhǔn)品(批號(hào)：10759350)。紫外酶法采用羅氏cobas 8000 c702+朗道肌酐紫外酶法檢測(cè)試劑(批號(hào)：311656)+朗道肌酐校準(zhǔn)品(批號(hào)：1512CR)；質(zhì)控品采用朗道CONTORL2(批號(hào)：821UN)和CONTORL3(批號(hào)：647UE)。干擾藥物：羥苯磺酸鈣膠囊采用寧夏康亞藥來有限公司制劑(規(guī)格：每粒0.25 g)；酚磺乙胺注射液采用山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司制劑(規(guī)格：每支0.5 g/2 mL)。

1.3方法 為確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，以下試驗(yàn)均在室內(nèi)質(zhì)控在控的情況下進(jìn)行。

1.3.1精密度試驗(yàn)

1.3.1.1批內(nèi)精密度 依照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLIS)EP5-A2文件要求，選擇接近醫(yī)學(xué)決定水平標(biāo)本2份，在2 h內(nèi)，各進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)及變異系數(shù)(CV%)。要求所有檢測(cè)數(shù)據(jù)中超出2SD的數(shù)據(jù)不超過2個(gè)。批內(nèi)精密度<1/4允許總誤差(TEa)為合格。

1.3.1.2批間精密度 取朗道質(zhì)控品CONTORL2、CONTORL3的2個(gè)水平，按每天4批、每批2個(gè)水平、每批間隔2 h的檢測(cè)頻率，連續(xù)檢測(cè)5 d，計(jì)算其均值、SD及CV%。批間精密度<1/3 TEa為合格。

1.3.2線性范圍試驗(yàn) 依照CLIS EP6-A文件要求，取2個(gè)接近廠家聲明線性范圍上限(H)、下限(L)的混合血清，按1 L、0.9 L+0.1 H、0.8 L+0.2 H、0.7 L+0.3 H、0.6 L+0.4 H、0.5 L+0.5 H、0.4 L+0.6 H、0.3 L+0.7 H、0.2 L+0.8 H、0.1 L+0.9 H、1 H的比例配制成11個(gè)系列濃度標(biāo)本，重復(fù)測(cè)定3次，在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定完成。以預(yù)期值為X，實(shí)測(cè)值為Y，以線性回歸分析獲得回歸方程后計(jì)算驗(yàn)證線性范圍。

1.3.3可報(bào)告范圍驗(yàn)證 取一份濃度落在線性范圍內(nèi)的高濃度患者標(biāo)本，用廠家推薦的稀釋液(生理鹽水)進(jìn)行5、10、20、50、100倍稀釋，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，以樣品原倍結(jié)果為預(yù)期值，稀釋后測(cè)定的結(jié)果為檢測(cè)值，計(jì)算各稀釋倍數(shù)的回收率，應(yīng)為90%～110%。

1.3.4方法學(xué)比對(duì) 依照CLIS EP9-A2文件，每天收集8份標(biāo)本，隨機(jī)編號(hào)，按順序和反序測(cè)定2次，共測(cè)定5 d。所有標(biāo)本均在2 h內(nèi)測(cè)定完成。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，剔除離群值。

1.3.5藥物干擾試驗(yàn) 依照CLIS EP7-A2 文件，通過配對(duì)差異干擾實(shí)驗(yàn)和劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，分析藥物：羥苯磺酸鈣(商品名：昊暢)和酚磺乙胺(商品名：止血敏)對(duì)3種肌酐檢測(cè)方法的干擾。

1.3.5.1配對(duì)差異干擾實(shí)驗(yàn) 按說明書描述，口服羥苯磺酸鈣膠囊500 mg，4 h達(dá)血藥濃度峰值，峰質(zhì)量濃度為14.5 μg/mL，故本研究選取0.0、14.5 μg/mL分別為羥苯磺酸鈣的最低和最高測(cè)試質(zhì)量濃度，貯存液質(zhì)量濃度為290 μg/mL。根據(jù)說明書描述，酚磺乙胺治療的血藥濃度為0.5～1.5 g/d，入血后l h達(dá)血藥濃度高峰，4～6 h完全排泄，故本研究中選取0.0、0.3 g/L分別為酚磺乙胺的最低和最高測(cè)試質(zhì)量濃度，貯存液質(zhì)量濃度為6 g/L。取3.8 mL配制的高肌酐值的混合血清加入藥物貯存液0.2 mL作為試驗(yàn)組,3.8 mL髙肌酐值血清加入0.2 mL去離子水作為對(duì)照組。分析羥苯磺酸鈣、酚磺乙胺對(duì)3種肌酐測(cè)定方法的干擾度。根據(jù)分析物的生理變異確定肌酐的TEa為6.9%[5],建立具有臨床意義差別的可接受標(biāo)準(zhǔn)的最大允許干擾值(dmax)。根據(jù)CLIS EP7-A2文件提供的dmax/s計(jì)算試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為3次。根據(jù)CLIS EP7-A2文件，95%CI的下限超過最大允許誤差[5]即認(rèn)為有干擾。

1.3.5.2劑量效應(yīng)試驗(yàn) 依照CLIS EP7-A2文件，制備一系列不同濃度的干擾測(cè)試樣本，以高濃度測(cè)試標(biāo)本和低濃度對(duì)照標(biāo)本按一定比例混合，制備方法見表1。

表1 劑量效應(yīng)試驗(yàn)標(biāo)本配制

1.3.6試劑穩(wěn)定性驗(yàn)證 3種試劑定標(biāo)后放置于羅氏cobas 8000 c702全自動(dòng)生化分析儀試劑倉(cāng)，分別于第1、2、3、4、5、6、7天測(cè)定朗道CONTORL2和CONTORL3，記錄統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用EXCEL2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1精密度 參照國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《臨床生物化學(xué)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量指標(biāo)》(WS/T403-2012)的要求，肌酐分析允許TEa為±12%，以CV批內(nèi)%<3%(<1/4TEa),CV批間%<4%(<1/3TEa)為標(biāo)準(zhǔn)，3種檢測(cè)方法均符合要求，結(jié)果見表2。

表2 批內(nèi)、批間精密度測(cè)定結(jié)果(%)

2.2線性范圍評(píng)估 3種肌酐測(cè)定方法線性范圍評(píng)估結(jié)果見表3。

表3 3種肌酐測(cè)定方法線性范圍評(píng)估結(jié)果

2.3可報(bào)告范圍 高濃度樣本經(jīng)5、10、20、50倍稀釋后回收率為90%～110%。3種肌酐測(cè)定方法可報(bào)告范圍評(píng)估結(jié)果見表4。

表4 3種肌酐測(cè)定方法可報(bào)告范圍評(píng)估結(jié)果

2.4不同方法學(xué)比對(duì) 紫外酶法與氧化酶法回歸方程為Y=0.948X+10.35(R2=0.999 2)。見圖1；紫外酶法與苦味酸法回歸方程為Y=0.966X+4.683(R2=0.999 6)。見圖2。

2.5藥物干擾

2.5.1配對(duì)差異干擾實(shí)驗(yàn) 羥苯磺酸鈣、酚磺乙胺對(duì)氧化酶法測(cè)定肌酐有負(fù)干擾，對(duì)其他2種方法無干擾，見表5、6。

圖1 紫外酶法與氧化酶法相關(guān)性分析

圖2 紫外酶法與苦味酸法相關(guān)性分析

檢測(cè)方法對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組95%CI最大允許誤差結(jié)果判斷紫外酶法436431-28～1830無干擾氧化酶法420328-104～-8029負(fù)干擾苦味酸法412409-17～1128無干擾

表6 酚磺乙胺配對(duì)差異試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2劑量效應(yīng)試驗(yàn) 羥苯磺酸鈣、酚磺乙胺均對(duì)氧化酶法檢測(cè)肌酐存在干擾。干擾效應(yīng)=試驗(yàn)組均值-對(duì)照組均值，結(jié)果見表7。羥苯磺酸、酚磺乙胺均對(duì)氧化酶法產(chǎn)生負(fù)干擾，其干擾效應(yīng)與不同藥物濃度的最佳擬合曲線方程見圖3、4。羥苯磺酸鈣對(duì)氧化酶法檢測(cè)肌酐的干擾效應(yīng)為線性回歸方程，產(chǎn)生干擾的最小有效質(zhì)量濃度為5.23 μg/mL。而酚磺乙胺對(duì)氧化酶法檢測(cè)肌酐的干擾效應(yīng)為非線性回歸方程，產(chǎn)生干擾的最小有效質(zhì)量濃度為0.016 g/L。

表7 劑量效應(yīng)試驗(yàn)

圖3 羥苯磺酸鈣干擾試驗(yàn)的線性效應(yīng)圖

圖4 酚磺乙胺干擾試驗(yàn)的非線性效應(yīng)圖

2.6試劑穩(wěn)定性試驗(yàn) 隨著開瓶時(shí)間的增加，苦味酸法檢測(cè)結(jié)果呈明顯持續(xù)下降，室內(nèi)質(zhì)控在開瓶第3天即提示失控，第7天的檢測(cè)結(jié)果與第1天比較，CONTORL2下降了42.5%,CONTORL3下降了34.4%，必須通過每天定標(biāo)方可穩(wěn)定結(jié)果；而2種酶法則表現(xiàn)穩(wěn)定，第7天的結(jié)果與第1天無明顯變化，見圖5。

圖5 試劑穩(wěn)定性試驗(yàn)

3 討 論

隨著生化檢驗(yàn)自動(dòng)化的普及和質(zhì)量控制措施的完善，生化檢驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性已顯著提高。但對(duì)有多種檢測(cè)方法的項(xiàng)目如肌酐，市場(chǎng)供應(yīng)的商品試劑品種多樣，加上檢測(cè)系統(tǒng)、測(cè)定方法及抗干擾能力的不同，使不同方法檢測(cè)結(jié)果之間依然存在明顯差異[6]。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對(duì)所用方法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以明確其性能特點(diǎn)及檢測(cè)局限性。

精密度既是臨床檢驗(yàn)的方法評(píng)價(jià)，也是儀器性能評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一[7]。3種肌酐檢測(cè)方法的精密度均符合廠家申明要求，同時(shí)，也滿足WS/T403-2012的要求。定量檢測(cè)項(xiàng)目在分析測(cè)量范圍內(nèi)儀器最終輸出的信號(hào)和分析物濃度呈線性是儀器性能的重要指標(biāo)，也是保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的理論依據(jù)。對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行線性評(píng)價(jià)有助于發(fā)現(xiàn)方法學(xué)原理、儀器、校準(zhǔn)品、試劑、操作程序、質(zhì)控計(jì)劃等很多方面的誤差來源[8]。本研究結(jié)果顯示，3種肌酐檢測(cè)方法均線性良好，3種方法可報(bào)告范圍評(píng)估完全可滿足臨床檢測(cè)需要。方法學(xué)比對(duì)實(shí)驗(yàn)是實(shí)現(xiàn)患者標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果可比性與準(zhǔn)確度溯源的重要途徑，本研究結(jié)果顯示，對(duì)無干擾物存在的正常標(biāo)本，3種肌酐檢測(cè)方法學(xué)之間具有良好的相關(guān)性。

干擾物是臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)誤差的一個(gè)很重要的來源[9]，其中患者治療期間的物質(zhì)介入是重要因素，臨床試驗(yàn)分析前藥物的影響因素時(shí)有發(fā)現(xiàn)[10]。本研究結(jié)果顯示，羥苯磺酸鈣在最小質(zhì)量濃度為5.23 μg/mL、酚磺乙胺在最小質(zhì)量濃度為0.016 g/L時(shí)即對(duì)氧化酶法產(chǎn)生負(fù)干擾，而對(duì)苦味酸法和紫外酶法無影響。3種藥物對(duì)氧化酶法檢測(cè)肌酐的干擾與其還原性有關(guān)[11-13]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，膽紅素對(duì)苦味酸法檢測(cè)肌酐具有顯著影響，存在明顯干擾[14-16]；維生素C對(duì)氧化酶法和苦味酸法均有不同程度干擾[17-18]，而膽紅素、乳糜、抗壞血酸、溶血及常用藥物均不干擾紫外酶法[19-20]。本研究試劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦味酸試劑的在機(jī)穩(wěn)定性較差，在控時(shí)間僅為2 d，明顯少于說明書聲明的7 d，而其他2種方法在機(jī)穩(wěn)定性均較好。

4 結(jié) 論

綜合分析3種方法的精密度、線性范圍、可報(bào)告范圍、抗干擾能力及試劑穩(wěn)定性，氧化酶法及苦味酸法具有明顯的缺點(diǎn)。而紫外酶法的性能符合臨床測(cè)定的需求，又具有較好的抗干擾能力，在3種肌酐測(cè)定方法中為最可靠的方法，應(yīng)作為實(shí)驗(yàn)室的首選方法。