HBV-DNA實時熒光定量檢測程序的測量不確定度評估及分析

劉偉平，楊新春，殷明剛

(自貢市第一人民醫院檢驗科，四川自貢 643000)

測量不確定度是一個與測量結果相聯系的參數，其表征合理地賦予被測量之值的分散性[1-2]。國際標準化組織(ISO)15189：2012《醫學實驗室質量和能力的專用要求》明確指出，實驗室應為檢驗過程中用于報告患者樣品被測量值的每個測量程序確定測量不確定度。實驗室應規定每個測量程序的測量不確定度性能要求，并定期評審測量不確定度的評估結果[3]。因此，進行測量不確定度評估對實驗室具有重要意義。檢驗項目的不確定評定可通過實驗室的室內質量控制和室間質量評價數據計算出來[4-7]。本研究采用實驗室室內質量控制的中間精密度和衛生部室間質量評價結果，計算了乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量項目的測量不確定度。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 StrataGene Mx3005P實時熒光定量PCR儀購自美國Agilent公司，HBV-DNA熒光定量檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司，室內質控品為自制質控品。

1.2方法

1.2.1檢測程序 每年定期對StrataGene Mx3005P實時熒光定量PCR檢測系統進行校準，同時，每年對HBV-DNA熒光定量檢測試劑盒進行性能評價，每批次試劑均進行留樣再測比對，確定檢測試劑盒的性能達到要求。自制HBV-DNA室內質控品，保存于-70 ℃超低溫冰箱，使用前進行全面性能評價，穩定性好。

1.2.2中間精密度測定 收集2016年10-12月獲得的相同批號室內質控結果，計算批間變異系數(CV%)，其數值等于實驗室內測量重復性引入的相對測量不確定度[urel(Rw)]。

2 結 果

2.1偏倚引入的測量不確定度評估結果 通過2014-2016年衛生部室間質量評價結果計算所得HBV-DNA偏倚引入的相對測量不確定度為5.27%。見表1。

2.2實驗室內測量重復性引入的測量不確定度評估結果 質控數據均值為4.03，實驗室內測量重復性引入的相對測量不確定度(urel)為3.45%。見表2。

表1 偏倚引入的測量不確定度評估結果

表2 HBV-DNA的中間精密度測定結果(n=40)

2.3HBV-DNA的相對擴展不確定度 由表1、表2計算得到相對合成標準不確定度(ucref)為6.3%；相對擴展不確定度為12.6%(K=2)。

3 討 論

醫學實驗室認可已成為我國三級甲等醫院檢驗科提升檢驗質量和能力的重要途徑。ISO15189實驗室認可明確要求實驗室要評估定量項目的測量不確定度。測量不確定度與檢驗總誤差概念和意義有一定區別[7]。

評定測量不確定度評定的意義主要體現在以下2個方面：(1)確認患者結果是否符合實驗室設定的質量目標，確定將患者結果與之前相同類型的結果或臨床決定值進行比對時其變化或波動值在多大范圍內有意義。(2)實驗室在解釋測量結果量值時應考慮測量不確定度。通過對不確定度的評價,可提高實驗室的檢測水平，有助于臨床醫生更好地理解、使用檢驗結果[8]。HBV-DNA定量已廣泛用于乙型肝炎患者臨床療效判斷和預后評估，測量不確定度結果可作為檢驗結果質量的參考依據[9-10]。

測量不確定度可在中間精密度條件下通過測量質控物獲得的量值進行計算，這些條件包括測量程序標準操作中盡可能多而合理的常規變化。評定偏倚的測量不確定度主要通過測量有證參考物質、利用室間質評等獲得[11-12]。

本研究采用弱陽性水平HBV-DNA質控品獲得的中間精密度和室間質量評價結果評定了HBV-DNA在該水平上的不確定度。實際測量過程相關聯的不確定度分量應從接收樣品啟動測量程序開始，至輸出測量結果終止。按本方法計算所得測量不確定度不確定來源上主要包含了分析測量階段中各種影響組分(如操作人員、儀器、試劑、校準品、質控品、環境條件等)的變異。但未包括與分析前和分析后階段相關的測量不確定度分量，也未包括由于人群生物學變異而產生的測量不確定度。

每個實驗室應建立自己的目標不確定度，以評價各檢驗指標是否滿足臨床要求[13-14]。目前，尚未有檢驗程序的測量不確定度的國家標準或性能規范，據文獻報道，擴展不確定度若大于10%，需改善檢測系統性能及穩定性，提高檢測的準確度和精密度[15]。本實驗室根據實驗室自身的條件，制定HBV-DNA的目標不確定度為10%。而本研究評定得到的相對不確定度(12.6%)略高于實驗室設定的目標不確定度，提示應從檢測人員、檢測儀器、檢測試劑和方法、所使用的校準品和質控品、環境溫濕度條件等方面入手，采取加強人員培訓、提高試劑質量、變更方法、加強儀器檢定和校準、嚴格控制環境溫濕度，逐步改進檢驗質量，以縮小測量不確定度，為臨床疾病的診治提供更有價值的參考依據。

4 結 論

HBV-DNA實時熒光定量檢測程序的測量不確定度評定具有重要意義，可作為臨床實驗室檢驗結果質量持續改進的依據，并用于解釋臨床檢驗結果。