兩步和三步法分離樣本資源庫抗凝血單個核細胞和血漿效果比較

叢 佳，徐 杰，代艷超，王子康，孫堅萍

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院血液內科，北京 100730；2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院，北京 100069)

轉化醫學[1-2]是目前醫學研究中的重點和熱點，而樣本庫資源庫則是轉化醫學研究的基石和重要組成部分。早在2009年北京市科委正式啟動疾病資源庫項目建設工作。北京佑安醫院以肝炎、艾滋病等傳染病人群為主體，建立了肝炎/艾滋病傳染病樣本資源庫[3-6]。在樣本資源庫中外周血單個核細胞(PBMC)和血漿是樣本資源庫儲存的重要樣本。PBMC包括B細胞、T細胞、NK細胞，單核細胞等，在評價免疫反應中至關重要[7]，在疫苗研究[8-9]和臨床試驗中也具有重要意義[10-11]；而血漿中各種細胞因子對評價機體炎性反應、腫瘤發生及轉移等具有重要作用。在樣本資源庫中對送檢標本如何處理會影響標本的質量。為更好地對標本進行質量控制，從而有利于后期科學研究，本研究比較了兩步和三步法分離外周血PBMC和血漿的效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集首都醫科大學附屬北京佑安醫院2017年2月至2017年4月送入樣本資源庫的標本，標本來源者均已簽署知情同意書。均為當天采集的新鮮抗凝血，無手術期輸血、輸液等干擾分離效果的標本。

1.2分離外周血PBMC和血漿的方法 用乙二胺四乙酸抗凝管(貨號367525，BD公司)采集外周血6～8 mL，將送檢標本混勻后平均分為2份。一份標本直接加入到Ficoll淋巴細胞分離液(貨號AS1114546，Axis-Shield公司)中，2 200 r/min離心20 min后進行分離PBMC和血漿提取，即兩步法。見圖1A。一份標本2 200 r/min離心7 min后先提取血漿，再加入預溫的1640培養基(貨號SH30809.01B，Hyclone公司)稀釋到原來體積，加入到淋巴細胞分離液中2 200 r/min離心20 min后分離PBMC，即三步法。見圖1B。分離的PBMC加入適量RPIM-1640混合均勻洗滌后進行細胞計數，而血漿放置于-80 ℃冰箱備用。

注：A表示兩步法；B表示三步法

圖1不同處理方法示意圖

1.3細胞計數 采用吖啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)染液(貨號CS2-0106-5ml，Nexcelom公司)對細胞進行計數，AO為浸潤性染料(膜通透性)，可侵入活細胞與雙鏈DNA結合發出綠色熒光、與單鏈DNA(變性DNA)結合發出紅色熒光；PI為排斥性染料(膜不通透性)，不能進入活細胞，與死亡或正在死亡(膜通透性改變)的細胞核酸結合，發出紅色熒光。AO/PI雙染色可區分活細胞與死亡細胞。具體操作：取PBMC懸液20 μL，與AO/PI染料按1∶1比例混勻；取20 μL混勻液加入到細胞計數板(貨號SD100，Nexcelom公司)中，然后插入到自動細胞計數儀(cellcounter，Nexcelom公司)中，自動計數活細胞數、總細胞數和細胞活性。

1.4檢測血漿中細胞因子水平 將凍存的血漿解凍后選取能評價炎癥、免疫狀態、腫瘤發生的27種血漿細胞因子，見表2。利用美國Biorad公司試劑盒進行檢測。根據試劑盒操作說明書采用Luminex高通量技術進行檢測，檢測儀器為美國Luminex 200液相懸浮芯片系統。

2 結 果

2.1不同方法分離PBMC效果比較 2種方法分離的活細胞數、總細胞數及活細胞比例結果相近，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同方法分離PBMC效果比較

2.2不同方法對血漿細胞因子水平的影響比較 兩步法血漿細胞因子水平均低于三步法，除GM-CSF和IP-10外，其余25種細胞因子比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同方法對血漿細胞因子水平的影響比較

續表2 不同方法對血漿細胞因子水平的影響比較

3 討 論

由于樣本資源庫中的臨床樣本是不可再生的寶貴資源，而高質量臨床樣本對科學研究具有極其重要的意義[12]。如何科學、高效、標準化地采集、處理、儲存高質量樣本資源，建立高質量資源庫，使之更好地為轉化醫學服務至關重要[13]。樣本資源庫中標本分離方法對標本質量影響較大，本研究比較了兩步和三步法對PBMC分離和血漿細胞因子水平的影響。

從操作方面看，兩步法處理時間短，操作少于三步法。但在PBMC分離效果方面，在活細胞數、總細胞數及活細胞比例方面，兩步法與三步法的結果基本一致，差異均無統計學意義(P>0.05)，提示在分離PBMC時可采取兩步法，這樣操作少且省時。也有研究對不同PBMC分離技術方法進行了比較，為利用PBMC而進行的下游應用研究提供了基礎，從而可選擇最佳PBMC分離方法[15]。

本研究比較了2種方法分離后的血漿細胞因子水平，結果顯示，兩步法分離血漿中的細胞因子水平均低于三步法，其中25種細胞因子比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，從表2可見，采取兩步法分離的血漿大部分細胞因子水平僅為三步法的2/3，甚至更低，這種差異會對后期研究造成極大影響。究其原因，可能在于兩步法分離的血漿，因為在分離血漿前就加入了淋巴細胞分離液，從而影響了血漿細胞因子水平，具體機制尚不清楚，有待于進一步的驗證研究；而本研究中無論是兩步法還是三步法，均采用了先進的Luminex高通量技術，其差異應該與檢測技術無關；而檢測的27種細胞因子則涵蓋了能反映炎癥、腫瘤發生及轉移等的各種白細胞介素、細胞集落刺激因子、干擾素、血管生長因子等，則2種方法之間的差異也應該不是細胞因子的選擇差異所致。提示如后期研究涉及血漿細胞因子水平，那么樣本庫標本的血漿分離應采用三步法進行處理。

有研究觀察了不同處理時間、不同處理溫度等條件對血漿收集的影響，結果顯示，代謝產物與時間相關，隨時間延長，代謝產物會增多，故建議分離血漿應在3 h內進行，在該時間段內代謝產物數據很穩定[14]。由此可見，在不同實驗條件下分離的血漿質量會有很大差異。

4 結 論

本研究結果顯示，兩步法與三步法比較，在分離和收集PBMC方面效果類似，且步驟簡單，可節省時間；但兩步法分離的血漿細胞因子受到很大影響，不能真實地反映血漿細胞因子水平。