難治性慢性丙型肝炎中醫證型與HLA-DP基因SNP的相關性研究

韓豎霞，鄭 毅，彭曉明，趙友云△

(1.湖北省中醫院檢驗科，湖北武漢 430061；2.湖北省中醫藥研究院，湖北武漢 430074)

ThecorrelationanalysisbetweensyndrometypesoftraditionalChinesemedicineandHLA-DPgenepolymorphismsinpatientswithrefractorychronichepatitisC*

HANShuxia1,2,ZHENGYi1,2,PENGXiaoming1,2,ZHAOYouyun1,2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan,Hubei430061,China;2.HubeiProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Wuhan,Hubei430074,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the correlation between syndrome types of traditional Chinese medicine (TCM) and HLA-DP gene polymorphisms in patients with refractory chronic hepatitis C (RCHC),and to find suitable molecular markers for TCM syndromes and provide scientific basis for TCM syndrome differentiation.MethodsA total of 200 RCHC patients of Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine were enrolled retrospectively.Their general characteristics,TCM syndromes,data of liver function (ALT，AST，ALP and ALB),HCV RNA,HCV genotypes,PT and PLT were collected.At the same time,100 patients from other departments of the hospital were enrolled as control group.FQ-PCR was used to detect the genotypes of the HLA-DP gene rs9277535 sites of the RCHC patients with different TCM syndromes and the patients of control group.The correlation between the data and TCM syndromes was statistically analyzed.ResultsAmong 200 patients in the study,the pattern of liver-depression and spleen-deficiency was maximum (100 cases,50.0%),while the remaining syndromes were dampness and heat resistance (48 cases,24.0%),yin deficiency of liver and kidney (32 cases,16.0%) and obstruction of collaterals by blood stasis (20 cases,10.0%).For age,data of liver function index and HCV RNA,there was no statistical difference between the liver-depression and spleen-deficiency type and other TCM syndromes (P>0.05).But the difference of PT was significant between liver-depression and spleen-deficiency type and other TCM syndromes (P<0.05).Compared with control group,there was no significant difference between the HLA-DP gene rs9277535 genotype GG and AA in the liver depression spleen deficiency group and the non-liver depression spleen deficiency group in the RCHC patients (P>0.05).ConclusionThere was no significant difference between the genotypes of HLA-DP gene rs9277535 genotype GA heterozygous genes and AA homozygous genes in the different TCM syndromes of RCHC patients.However,the distribution of alleles G and A in liver depression spleen deficiency group and non-liver depression spleen deficiency group showed a different trend,which is worthy of further study.

Keywords:refractory chronic hepatitis C; traditional Chinese medicine； syndrome; HLA-DP; polymorphisms； HCV

丙型肝炎是嗜肝病毒中丙型肝炎病毒(HCV)引起的一種肝炎，感染后可以導致肝臟炎癥性壞死甚至導致肝硬化和肝癌,由于其進展隱匿、慢性率高及預后不良而備受關注[1]。以干擾素為基礎的治療方案在臨床上一度居于主導地位，但由于療程長、有效率低、不良反應大等許多問題仍未得到根本解決，使得在治療過程中，存在治療無應答者、不耐受者、停藥后復發者等，即難治性慢性丙型肝炎(RCHC)的產生[2]。

中醫以其整體觀和辨證論治的特點，在治療RCHC上有一定的優勢，可以通過分析不同患者的中醫證型來進行個體化用藥。然而，由于目前缺乏統一明確的丙型肝炎辨證分型標準，臨床分型存在一定程度的主觀性和隨意性[3]。因此，需要尋找一種可重復、準確可靠的分子標志物以揭示中醫證型的內涵，以此更好地指導臨床醫生個體化用藥。白細胞抗原(HLA)DP基因編碼HLA-DP抗原，此抗原的多少直接影響抗原遞呈與免疫應答的過程。因此，本研究旨在探索人類HLA-DP基因單核苷酸多態性(SNP)常見位點的基因型與RCHC中醫證型是否存在相關性，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 200例RCHC患者均為2015年1月至2016年12月在湖北省中醫院住院的患者，按中醫證型分為肝郁脾虛組和非肝郁脾虛組(含肝腎陰虛型、濕熱內阻型、淤血阻絡型)。其中肝郁脾虛組男55例，女45例，年齡20～80歲，平均54.45歲；非肝郁脾虛組男53例，女47例，年齡26～80歲，平均59.05歲。100例對照人群為湖北省中醫院骨科、肛腸科、耳鼻喉科住院患者，性別和年齡與RCHC患者差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2診斷標準 RCHC的診斷均參考《丙型肝炎防治指南(2015更新版)》[4]； 肝郁脾虛型、肝腎陰虛型、濕熱內阻型、淤血阻絡型的中醫證型分型參考2017年中華中醫藥學會肝膽病專業委員會制訂的《病毒性肝炎中醫辨證標準(2017年版)》[5]，以上判定均由兩位主治醫師共同判斷，并由一位主任醫師審核確定。

1.3納入與排除標準 納入標準：符合上述RCHC診斷標準且符合中醫證型者，均簽有知情同意書。排除標準：合并HIV和(或)其他嗜肝病毒感染的肝炎；伴有心、腎、肺、內分泌、血液、代謝及胃腸道嚴重原發病；不能合作者或精神病患者；哺乳、妊娠或正準備妊娠的婦女，以及過敏體質者。

1.4檢測指標

1.4.1常規指標 肝功能相關指標[丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、清蛋白(ALB)]由RoCH moduleP800全自動生化分析儀完成；HCV RNA檢測采用美國ABI Dx全自動熒光定量PCR儀完成；血小板計數(PLT)由貝克曼DxH 800完成；凝血酶原時間(PT)檢測采用沃芬ACLTOP700完成。

1.4.2基因組DNA的提取及HLA-DP基因分型 按湖北省中醫院用戶手冊標準采集所有研究對象外周靜脈EDTA抗凝血液5 mL；依照基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司生產)操作說明書的步驟提取人類基因組DNA；再采用超微量核酸分析儀(Eppendorf公司，德國)測定DNA濃度；根據HCV基因組5′-UTR、C/E1和NS5B的序列及HLA-DP基因rs9277535位點G/A，采用Vector NTI11.0軟件設計引物和探針序列，送上海生工生物工程有限公司合成引物和探針序列，見表1。采用優化后的雙重FQ-PCR技術同步檢測標本中HLA-DP基因rs9277535位點G或A。優化后的雙重熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)反應體系：2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 5.00 μL，10 μmol/L正向引物0.25 μL，10 μmol/L反向引物0.25 μL，10 μmol/L A-、G-探針各0.20 μL，DNA模板0.20 μL，ddH2O 2.10 μL。

2 結 果

2.1RCHC中醫證型的分布 200例RCHC中醫證型中，肝郁脾虛證最多(100例)，占50.0%；其次分別是濕熱內阻證(48例)，占24.0%；肝腎陰虛證(32例)，占16.0%；淤血阻絡證(20例)，占10.0%。

2.2RCHC肝郁脾虛證和非肝郁脾虛證的基本信息和常規指標 RCHC肝郁脾虛證與非肝郁脾虛證相比，肝功能指標、HCV RNA含量及其基因型差異均無統計學意義(P>0.05)；其中RCHC患者不同證型的HCV基因型均以1b型為主，凝血系統中PT指標差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 HLA-DP基因rs9277535位點的FQ-PCR引物及探針序列

2.3RCHC不同證型患者HLA-DP基因rs9277535多態性 HLA-DP基因rs9277535位點中，與野生純合型GG相比，GA雜合型和AA突變基因型在對照組、肝郁脾虛組和非肝郁脾虛組3組中的差異均無統計學意義(P>0.05)；等位基因G、A的分布在3組中差異也均無統計學意義(P>0.05),見表3。

表2 不同中醫證型RCHC患者基本信息和常規指標比較

注：*表示肝腎陰虛型或濕熱內阻型或淤血阻絡型中任一證型均歸為非肝郁脾虛組

表3 RCHC不同證型患者HLA-DP rs9277535多態性的分布情況[n(%)]

注：*為非肝郁脾虛組指肝腎陰虛型或濕熱內阻型或淤血阻絡型；#為對照組與肝郁脾虛組比較；△為對照組與非肝郁脾虛組比較；▲為肝郁脾虛組與非肝郁脾虛組比較

3 討 論

近年來，人們對于慢性丙型肝炎的認識不斷深入，國家衛生健康委員會疾病預防控制局官網發布的數據顯示，每年該病的發病率和病死率也呈上升趨勢。雖然中醫、西醫對慢性丙型肝炎的研究已經取得了很大的進展，治療方面也取得了很大的突破，已有聚乙二醇干擾素(Peg-IFN)聯合利巴韋林(RBV)的標準化治療方案和DAA治療方案，特別是DAA的上市是丙型肝炎治療的一次飛躍，使其治愈率大大提高[6]。但由于我國丙型肝炎患者的高SVR率、居民經濟承受能力、衛生經濟學因素、DAA高昂的價格、未知的遠期耐藥、復發和藥物間相互作用等諸多原因，使得Peg-IFN聯合RBV治療仍然是我國現階段丙型肝炎抗病毒治療的主要方案[7]。在治療過程中存在治療無應答者、不耐受者、停藥后復發者；HCV的基因型為1型者；伴有肝炎肝硬化、非酒精性脂肪肝、代謝綜合征、胰島素抵抗者；HBV/HCV、HIV/HCV重疊感染者；器官移植患者等，均導致了RCHC的產生[8-10]。因此，RCHC已成為目前困擾肝病領域的重要科學問題。

HLA-DP分子主要分布于抗原遞呈細胞(APC)，如巨噬細胞、樹突狀細胞、B淋巴細胞、胸腺上皮細胞和活化的T細胞等的表面。HLA-DP基因屬于HLA-Ⅱ類基因，位于染色體6p21.23，其基因多態性與機體免疫應答相關，在肝硬化基因研究中，HLA基因逐漸受到關注。有學者通過Meta分析發現HLA-DP基因rs9277535位點A等位基因為HBV感染的保護因素，可顯著增加HBV自發清除[11]。HUANG等[12]研究證實，HLA-DP rs9277535基因突變型與HCV持續感染和丙型肝炎慢性化進展速度相關，同時該基因還與肺癌、卵巢癌的發生風險，兒童HBV易感性，系統性紅斑狼瘡易感性等密切相關。

中醫證型是RCHC辨證施治的關鍵。HLA-DP基因多態性與HCV持續感染密切相關，其個體化理念與中醫辨證施治高度相似，課題組提出HLA-DP基因多態性與RCHC中醫證型相關性的科學假說，尋找中醫證型的分子標志物，為中醫辨證提供科學依據。本研究結果顯示，RCHC肝郁脾虛證與非肝郁脾虛證相比，肝功能、HCV-RNA水平及其基因型差異均無統計學意義(P>0.05)，但HCV基因型均以1b型為主；同時年長的RCHC患者更易出現非肝郁脾虛證，即肝腎陰虛型或濕熱內阻型或淤血阻絡型；凝血系統中PT指標差異有統計學意義(P<0.05)。

研究發現，HLA-DP基因rs9277535位點中，與野生純合型GG相比，GA雜合型和AA突變基因型在對照組、肝郁脾虛組和非肝郁脾虛組3組間均無顯著性差異；但等位基因G和A的分布在肝郁脾虛組和非肝郁脾虛組2組間有差異趨勢，可作為中醫證型分型的潛在標志物，對于傳統中醫理論研究具有一定的創新價值，可進一步研究。

4 結 論

本課題組在RCHC中醫證型分子分型研究中，發現肝郁脾虛證最多，肝臟功能損傷程度及病毒水平在不同證型之間差異無統計學意義。HLA-DP基因rs9277535位點中等位基因G和A的分布在不同證型間有一定的差異趨勢，因此，推斷rs9277535位點中等位基因G和A可能是RCHC不同中醫證型的潛在標志物，值得關注。本研究雖然得出了可能與RCHC中醫證型密切相關的HLA-DP等位基因，但仍然難以明確定論。同時，由于本研究病例僅來自湖北省中醫院，各種證型的病例數偏少，不夠全面。因此，為更準確地反映HLA-DP基因SNP與RCHC中醫證型的相關性，尚有待進一步擴大樣本量，開展多地域、多民族的深入研究，以探索中醫證型的分子機制。