手工制作組織芯片的方法

朱偉峰 彭鳳英 翁秀琴 蔡曉雯

組織芯片（Tissue Chips）是把數十個至數百個患者的組織整齊有序的排列到同一個蠟塊上，進而制成組織切片用于HE、組化染色、DNA和RNA檢測分析等[1]。1998年Kononen等首次提出組織芯片的概念并證實組織芯片的實用價值[2]。從此組織芯片得到飛速發展，它最大的作用是將基因、蛋白水平的研究與組織形態學相結合，應用同一實驗條件同時研究大量不同患者組織樣本（高通量），減少實驗誤差，使實驗結果更可靠，極大地提高實驗效率，并節約實驗成本和人力[3-5]。但組織芯片技術一般采用進口的組織微陣列儀或組織芯片制作儀，價格高，不適于基層[6]。本文通過臨床經驗及設計，介紹一種建議組織芯片制作方法，操作簡單，效果滿意，適用性廣泛，以供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2015年12月—2017年12月福建省腫瘤醫院病理科60例肺癌患者病例制作組織標本。

1.2 儀器設備

石蠟（德國 Leica，Histowax），組織芯片儀（Quick-Ray 韓國UNITMA），Thermo切片機（HM325），隔水式培養箱（上海一恒科學儀器有限公司，型號為GHP9180），一次性刀片（Leica），Leica攤片機（型號為HI 1210）和Leica烤片機（型號為HI 1220），Thermo包埋機（HISTOSTAR）。

1.3 方法

1.3.1 組織處理 所有標本均經4%中性緩沖福爾馬林固定，取材，脫水，包埋，切片和HE染色。

1.3.2 組織芯片制作過程 （1）空白蠟塊制作：把高熔點的蠟（58～60℃）制成空白蠟塊；（2）軟化：把空白蠟塊倒扣在烤片板上軟化石蠟；（3）組織芯片設計：根據患者例數及空白蠟塊用記號筆設置位點，選擇手工芯片儀直徑2 mm的取樣頭；（4）打孔：將取樣頭在軟化空白蠟塊上穿孔；（5）取樣：病理醫師HE鏡下選取代表性區域并用記號筆標記并與對應蠟塊進行取樣定位并倒扣在60℃烤片板，用組織芯片搶取樣并按照芯片陣列設計圖打入對應的軟化蠟塊孔，依次將所有樣本植入芯片蠟塊；（6）移除加樣好的芯片蠟塊使之硬化收縮并抹平使各個組織盡量在同一平面，用刀片使組織芯片與包埋盒分離；（7）二次包埋：在60℃溫箱用低熔點的蠟（56℃）把組織芯片放包埋框，觀察到芯片蠟塊達到相應的溶解狀態時重新包埋，放入冰盤或冷凍臺冷卻；（8）蠟塊儲存：蠟塊冷卻后使之與包埋框分離，除去蠟塊四周蠟邊備用。

1.3.3 組織芯片切片 組織芯片切片步驟：（1）組織芯片蠟塊放4℃冰箱預冷保證芯片溫度一致，有利于切片；（2）取出固定于切片頭，認真耐心的調試切片刀和蠟塊面的角度，減少修片造成的組織損傷，盡量選用鋒利的一次性刀片，然后做3μm厚的連續切片；（3）低濃度酒精漂片；（4）48℃水浴展片；（5）防脫帶膠片撈片；（6）風干、60℃烤片板烤片30 min后常溫備用。

2 結果

制備的組織芯片各個組織為所要組織形態學區域，蠟塊完整，組織排列整齊，蠟塊未見開裂及組織丟失，組織與蠟塊結合緊密，組織芯片能被完整切出。

3 討論

組織芯片與傳統石蠟切片相比，組織芯片在實驗結果的可靠性、科學性、可比性上都具有優越性[7]。同樣我們也可以將芯片用于制作免疫組化對照用的“套餐式”芯片[8]，Low等[9]報道了一種“香腸”組織包埋法，費時、費力且耗材，隨后經過多次改良也制成多組織陽性對照片，用于免疫組化染色。通過組織芯片的制作過程我們應認識并了解它在實驗室的重要地位，不斷發展組織芯片技術。

本實驗方法簡單易行，受體蠟塊也是自己制備，幾乎不需要任何費用，制作組織芯片涉及較多的蠟塊和切片，制作步驟較多，因此，其操作過程要求細致精準，否則組織芯片的完整性就難以保證。通過在組織芯片的制作過程中，總結以下幾點注意事項：（1）患者標本的選取：一定要把蠟塊和相應的HE對應清楚，因為標本存放時間長，可能收縮變形導致HE上標記的位點和蠟塊對應的位置有誤差[10]，可能導致取到無效組織，所以盡量選取組織豐富區域（一般都是診斷醫生定位）；（2）受體蠟塊制備嚴格按照組織陣列設計圖操作，避免錯樣、漏樣；（3）制作受體蠟塊烤片板預熱使蠟軟化便于穿孔，防止蠟開裂[11]；（4）鉆頭在使用前用電吹風或放溫箱預熱，再放入二甲苯或松節油浸泡除去殘留蠟；（5）芯片抹平很重要，可以保證組織因為切面不平展而導致切片損傷組織，可以在組織全部打入孔后反過來把切面在試驗臺上壓實抹平；（6）包埋石蠟與受體石蠟熔點接近，這樣更有利于石蠟的融合，也會有利于切片；（7）由于組織芯片包含各種各樣或者時間長短不一的組織，而組織的質地和軟硬都不盡相同，所以盡量用鋒利的刀片切片，這樣也比較不易出現刀痕皺褶[12]；（8）組織芯片在切片時調整切片切面要求嚴格，前期角度調整后可減少組織較薄位點的損失；（9）組織芯片要切片完整、美觀、厚薄均勻、無刀痕皺褶，這對操作人員的技術水平有極高的要求，一塊組織芯片的組織數量越多，它的制作難度就越大。

總之，組織芯片的實用性很高，它的制作是一項經濟高效的技術。操作人員要通過細心了解，耐心安排，專心的操作，盡量保證組織芯片的制作質量。