多肽改性二醋酸纖維素納米纖維的制備及抗菌性能

邴紹苗，熊 健，覃小紅，張弘楠

(東華大學 a. 上海市微納米紡織重點實驗室；b. 紡織學院， 上海 201620)

紡織品在人體穿著過程中會粘染很多皮膚分泌物，同時也會受到環境污染物的影響，常常是微生物細菌繁殖和傳遞的重要媒介[1]。若能為紡織品賦予一定的抗菌功能，則可有效避免紡織品因微生物侵蝕而出現的受損，還可以阻斷病菌的傳播途徑[2]。靜電紡絲技術是近年興起的一種簡單有效的納米纖維制備方法，采用靜電紡絲生產抗菌紡織品的技術引起了醫療領域的極大關注[3-8]，但抗菌紡織品的抗菌穩定性往往達不到消費者的使用需求。

抗菌劑主要分為3類：天然抗菌劑、有機抗菌劑和無機抗菌劑。其中，天然抗菌劑主要包括甲殼質、殼聚糖[9-11]以及抗菌性蛋白質等，無機抗菌劑主要有銀沸石、銀硅膠以及銀活性炭等[12-13]，有機抗菌劑有季銨鹽、胍類等。但無機和有機抗菌劑易造成環境污染，并對人體健康有一定危害作用，而且如使用時間較長、使用方法不規范將導致其抗菌效果逐漸喪失，進而導致耐藥細菌甚至超級細菌的產生[14]。大量研究證明，抗菌多肽(peptide)作為替代類抗菌藥物，具有傳統抗菌藥物不可比擬的優勢[15]，其主要通過物理作用破壞微生物細菌的磷脂雙分子層而使細菌的細胞質組分滲漏，或者與細菌細胞內的蛋白質、核酸等物質反應進而導致細菌死亡，具有非特異性、適用范圍廣、效力持久穩定、不會產生耐藥性的特點[16]。

目前生產抗菌紡織品主要有兩種方法：一是紡絲法，即在紡絲過程中加入抗菌物質，由抗菌纖維制成相應的抗菌紡織品[17]；二是后整理，即通過印花、浸漬、浸軋等方法將抗菌劑整理到織物上[18]。但是經后整理處理得到的紡織品通常耐洗性較差，且織物原有的物化性能容易發生變化，而且由于抗菌劑只存在于纖維表面，其初期溶出量較大，存在穿著安全性問題[19]，并且在洗滌過程中抗菌劑易脫落，容易造成環境污染。因此，在靜電紡絲過程中，學者們[20-21]通過在紡絲液中摻入抗菌功能性納米顆粒以實現紡織品的抗菌功能化處理，但這又存在由紡絲液中的納米顆粒所帶來的靜電紡絲可紡性差、抗菌劑易流失、抗菌效率低、纖維力學性能差等問題[22]。此外，動物試驗證明，某些納米抗菌顆粒對人體是有害的[23-24]。

針對上述問題，選用化學接枝法將抗菌多肽接枝到二醋酸纖維素(CDA)上，避免了由簡單摻雜、共混紡絲等技術所導致的納米粒子的不穩定性和聚集效應，提高了抗菌功能的均勻性和可靠持久性。通過靜電紡絲制備改性二醋酸纖維素(CDA-g-peptide)納米纖維，并對其外觀形貌、力學性能、抗菌效果及抗菌效果的穩定性進行表征。靜電紡絲二醋酸纖維素纖維生物相容性好、可降解、化學性質穩定、熱穩定性好[25]，制成的紡織品透氣、吸汗，同時具有低致敏性，可用于與皮膚直接接觸的繃帶、敷料以及家用紡織品等[26]。改性二醋酸纖維素納米纖維進一步拓展了其在抗菌功能紡織品領域的應用。

1 試驗部分

1.1 試劑與原料

三氯三苯甲基氯樹脂，HOOC—(R)CH—NH—Fmoc，N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，1-羥基苯并三唑(HOBT)，吉爾生化上海有限公司；哌啶，茚三酮，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)，二氯甲烷(DCM)，三氟乙酸(TFA)，無水乙醚，丙酮，無水乙醇，丁二酸酐(SA)，三乙胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

二醋酸纖維素由南通醋酸纖維公司提供，呈白色粉粒狀或片條狀，取代度為2.43，特性黏度為1.45，數均相對分子質量為8.4×104。

1.2 試驗過程

1.2.1 多肽的合成

抗菌多肽的合成路線如圖1所示。多肽鏈從樹脂上切落后，經抽濾、旋蒸濃縮，再用無水乙醚沉淀，將沉淀物真空干燥，得到抗菌多肽。

1.2.2 CDA-g-peptide制備

CDA純化。稱取一定量CDA，將其溶解在丙酮中，再用無水乙醇沉淀，低溫靜置12 h，抽濾后干燥。

CDA-g-SA制備。稱取2.0 g純化CDA，將其溶解于提純丙酮中，加入0.5 g SA、5 mL三乙胺，將反應溫度升至65 ℃左右，反應24 h。反應完后，用無水乙醇沉淀后干燥。其合成原理如圖2所示。

圖1 抗菌多肽的合成路線示意圖Fig.1 Synthetic processes of antibacterial peptide

圖2 CDA-g-SA的合成原理Fig.2 The synthetic principle of CDA-g-SA

CDA與抗菌多肽(peptide)接枝。稱取1.0 g CDA-g-SA，冰浴下溶解于干燥DMF中，加入0.5 g EDC、0.4 g NHS，反應12 h；然后將0.2 g peptide溶解在少量DMF中，轉移至反應燒瓶中，反應12 h。 反應完后，用無水乙醇沉淀后干燥。CDA-g-peptide合成原理如圖3所示。

圖3 CDA-g-peptide合成原理Fig.3 The synthetic principle of CDA-g-peptide

1.2.3 CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維制備

由前期預試驗獲得CDA和CDA-g-peptide兩種溶液紡絲性能相對穩定的參數，溶劑體系選用(丙酮∶DMAC=2∶1)混合溶劑，溶質(CDA或CDA-g-peptide)的質量分數為10%。稱取一定量的CDA、 CDA-g-peptide、丙酮和DMAC，分別在混合溶劑中加入兩種溶質，磁力攪拌12 h，靜置4 h。

在室溫下，控制環境相對濕度在40%左右，采用單針頭靜電紡絲，保持兩種紡絲液流速均為0.3 mL/h、紡絲電壓為15 kV，接收距離為20 cm。

1.3 測試方法

采用TM-3000型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維的表觀形態，并使用Nano Measurer軟件測量納米纖維的直徑(隨機選取100個不同位置)。采用Mettler Toledo Seven2Go型電導率儀測試CDA和CDA-g-peptide紡絲液的電導率。采用PerkinElmer Spectrum Two型傅里葉變紅外光譜儀(FTIR)分析多肽、CDA和CDA-g-peptide的分子基團變化。采用XQ-2型纖維拉伸強度儀(隨機選取納米纖維膜不同位置，膜長度為50 mm，寬度為3 mm，拉伸速度為10 mm/min)，測試CDA納米纖維膜和CDA-g-peptide納米纖維膜的拉伸斷裂強力及斷裂伸長率。

1.4 抗菌試驗

選取金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性致病菌)和大腸桿菌(革蘭氏陰性致病菌)作為測試菌種，參照GB/T 20944.1—2007采用瓊脂平皿擴散法表征CDA-g-peptide納米纖維的抗菌效果，其抗菌效果的評價標準如表1所示。抗菌性能的評價參考GB/T 20944.1—2007中的振蕩法，有2個評價指標：一是試驗有效性F的判斷，對于金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等細菌，當F≥1.5，且對照燒瓶中的活菌濃度比接種時的活菌濃度增加時，試驗判定有效，否則試驗無效，需重新進行試驗；二是抑菌率的計算，當對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌率≥70%時，樣品具有抗菌效果。

表1 CDA-g-peptide納米纖維抗菌效果評價Table 1 Evaluation of antibacterial effect of CDA-g-peptide nanofibers

1.5 抗菌效果的穩定性評價

由FZ/T 73023—2006可知，抗菌效果的穩定性一直是評價抗菌產品優劣的重要指標。但目前的評價標準并未對其做出統一有效規定，而且由于制備方法、使用原料差異，各類抗菌產品所適用的評價方法也無法一概而論。為此，考慮到CDA-g-peptide納米纖維的制備方法及其在紡織服裝中反復洗滌使用的特點，將CDA-g-peptide納米纖維置于去離子水中，放在37 ℃恒溫振蕩器中振蕩，模擬不同時間的洗滌過程對抗菌性能的影響。然后將納米纖維置于細菌培養液中，測試不同振蕩時間處理過的納米纖維對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率的變化，并與未振蕩處理的對比，評價CDA-g-peptide納米纖維的抗菌穩定性。

2 結果與討論

2.1 多肽的表征

圖4 多肽與氨基酸原料的紅外吸收光譜Fig.4 The infrared absorption spectra of peptide and amino acid material

2.2 CDA-g-peptide的表征

圖5 CDA、CDA-g-SA、 CDA-g-peptide的紅外吸收光譜Fig.5 The infrared absorption spectra of CDA，CDA-g-SA and CDA-g-peptide

2.3 CDA和CDA-g-peptide納米纖維的表征

2.3.1 表觀形貌表征

CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維的SEM圖如圖6所示。由圖6可知：CDA納米纖維隨機排列，表面比較光滑，平均直徑為275.8 nm，變異系數較大；而CDA-g-peptide納米纖維隨機排列，少部分以串珠液滴的形式存在，但纖維的平均直徑為117.6 nm(比CDA納米纖維小得多)，且變異系數較小，表面比較光滑。影響纖維直徑的主要因素是電導率，CDA和CDA-g-peptide紡絲液的電導率分別為1.95和18.38 μS/cm。由于CDA-g-peptide引入了酰胺鍵等基團，提高了其紡絲液的電導率，故相同紡絲條件下纖維較細，雖然相對分子質量分布寬并且存在串珠，但纖維直徑分布依然較窄。

(a) CDA納米纖維SEM圖

(c) CDA-g-peptide納米纖維SEM圖

(d) CDA-g-peptide納米纖維直徑分布圖圖6 CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維SEM圖和纖維直徑分布圖

Fig.6SEMimagesandfiberdiameterdistributionofCDAnanofibersandCDA-g-peptidenanofibers

2.3.2 力學性能表征

圖7 CDA 納米纖維膜和CDA-g-peptide納米纖維膜的負荷伸長曲線Fig.7 Load-elongation curves of CDA nanofiber membranes and CDA-g-peptide nanofiber membranes

CDA納米纖維膜和CDA-g-peptide納米纖維膜的平均負荷伸長曲線如圖7所示。由圖7可知，CDA納米纖維膜最大拉伸負荷大于CDA-g-peptide納米纖維膜，但二者的斷裂伸長率相近。當外加負荷一定時，CDA-g-peptide納米纖維膜的變形能力要大于CDA納米纖維膜的變形能力，并且CDA-g-peptide納米纖維膜的初始模量小于CDA納米纖維膜，即在小變形條件下，CDA納米纖維膜抵抗外力變形的能力更強，二者的力學性能存在一定差異。

3 CDA-g-peptide納米纖維的抗菌性能測試

大腸桿菌的生長曲線如圖8所示。大腸桿菌生長曲線可劃分為4個階段。其中：0～3 h為遲緩期，大腸桿菌的繁殖速度很慢，曲線較平緩；4～9 h為生長期，大腸桿菌快速增殖；10～16 h為穩定期，大腸桿菌總數基本穩定，這是由于隨著大腸桿菌的繁殖，營養物質不斷減少，并且代謝產生的有害物積累，大腸桿菌的增長速度不斷變慢，其增殖數與死亡數大致相等；17～20 h為衰亡期，由于培養基中營養物質逐漸減少，而毒性物質逐漸增加，大腸桿菌的繁殖速度逐漸減緩，死亡數明顯增多，細菌總數呈現下降趨勢。

圖8 大腸桿菌的生長曲線圖Fig.8 Growth curve of E. coli

CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維對大腸桿菌的抗菌性能如圖9所示。由圖9可知，培養24 h后，CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維均沒有明顯的抑菌圈。但是去除對照樣(CDA納米纖維)和試樣(CDA-g-peptide納米纖維)后，對照樣接觸的培養基表面有大腸桿菌的生長，而試樣接觸的培養基表面沒有大腸桿菌生長。經過48 h培養后，CDA-g-peptide納米纖維接觸的培養基表面仍沒有大腸桿菌生長(如圖9(a)所示)。進一步采用振蕩法與平板菌落計數法相結合的方法評價其抗菌性能(如圖9(b)所示)。根據平板菌落計數法，得出試驗的F值為2.54，即試驗有效。CDA-g-peptide納米纖維對大腸桿菌的抑菌率為98.4%，大于評價標準中的抑菌率(70%)。由此證明CDA-g-peptide納米纖維對大腸桿菌的抗菌性能優異。

(a) 定性測試

(b) 定量測試圖9 CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維對大腸桿菌的抗菌性能測試Fig.9 E. coli antibacterial performance tests of CDAnanofibers and CDA-g-peptide nanofibers

圖10 金黃色葡萄球菌的生長曲線圖Fig.10 Growth curve of S. aureus

金黃色葡萄球菌的生長曲線如圖10所示。金黃色葡萄球菌的生長曲線可劃分為3個階段。其中，0～4 h為遲緩期，金黃色葡萄球菌的繁殖速度很慢；5～12 h為生長期，培養基中的營養物質豐富，金黃色葡萄球菌快速增長；13～24 h為穩定期，金黃色葡萄球菌的總數基本維持穩定，菌落數目波動較小。這是由于隨著金黃色葡萄球菌數目的增多，營養物質不斷減少，而代謝產生的毒性物質積累等，金黃色葡萄球菌的繁殖速度逐漸下降，而死亡細菌數逐漸增加，總體上達到一種動態平衡。

CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維對金黃色葡萄球菌的抗菌性能如圖11所示。由圖11可知，與大腸桿菌的抗菌性能測試一樣，培養24 h后，兩組試樣均未出現明顯的抑菌圈，但是去除對照樣和試樣后，CDA納米纖維培養基上有細菌生長，而CDA-g-peptide納米纖維接觸的培養基表面沒有細菌生長。經過48 h培養后，CDA-g-peptide納米纖維接觸的培養基表面仍沒有細菌生長。進一步采用振蕩法與平板菌落計數法相結合的方法對其抗菌性能進行評價(如圖11(b)所示)。根據平板菌落計數法，F值為2.04，表明試驗有效。CDA-g-peptide納米纖維對金黃色葡萄球菌的抑菌率為98.7%，大于評價標準中的抑菌率(70%)。由此證明CDA-g-peptide納米纖維對金黃色葡萄球菌的抗菌性能優異。

(a) 定性測試

(b) 定量測試圖11 CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維對金黃色葡萄球菌的抗菌性能測試Fig.11 S. aureus antibacterial performance tests of CDAnanofibers and CDA-g-peptide nanofibers

4 CDA-g-peptide納米纖維的抗菌穩定性評價

經振蕩和未經振蕩的CDA-g-peptide納米纖維的抗菌測試結果如表2所示。對照樣(CDA納米纖維)培養基中長滿了菌落，而CDA-g-peptide納米纖維和經振蕩處理后的納米纖維的培養基中幾乎沒有菌落生長。經平板菌落計數法得出，振蕩12、 24、 48 h后的CDA-g-peptide納米纖維對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率與未經振蕩的CDA-g-peptide納米纖維基本一致，無顯著差異。故CDA-g-peptide納米纖維的抗菌效果穩定。

表2 不同振蕩時間對CDA-g-peptide納米纖維抑菌率的影響Table 2 Effect of different oscillation time on bacteriostatic rate

5 結 語

以抗菌多肽和CDA為原料，利用抗菌多肽的氨基自由基將抗菌多肽接枝在羧基化的CDA上，合成了具有抗菌功能的CDA-g-peptide。采用靜電紡絲技術，制備了CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維。由SEM圖可知，CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維在外觀形貌上存在一定差異。在力學性能方面，CDA納米纖維膜的斷裂強力優于CDA-g-peptide納米纖維膜，但二者的斷裂伸長率相差不大，并不會影響其后續加工使用。CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維的抗菌性能結果表明，后者具有優異的抗菌性能。由于抗菌多肽與納米纖維之間是化學鍵作用，而不是簡單摻雜、共混，故經不同振蕩時間處理后，其抗菌性能未出現明顯下降，具有抗菌可靠性和持久性。因此開發新型抗菌醋酸纖維基靜電紡絲納米纖維，可將其與傳統棉纖維、聚酯纖維混紡，在不影響其服用性能的前提下，賦予傳統紡織品高功能性和高附加值，拓展其在服用領域和醫療衛生領域的應用，具有較好的應用前景。