胃食管反流病相關檢驗項目及診斷研究

陳立柱 劉 嘉

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是胃、十二指腸內容物反流入食管，引起食管或其他部位損傷的一種消化系統常見疾病。根據食管下端病變情況，GERD分為3種類型：食管下端黏膜未破損的非糜爛性反流病(non-erosive reflux disease，NERD)、食管下端存在黏膜破損的反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)以及食管下端上皮化生為柱狀的Barrett食管(Barrett's esophagus，BE)[1]。研究表明，近10年來，胃食管反流病的發病率逐步上升，臨床上的預防和治療已引起人們的高度關注[2]。

GERD發生的原因主要是抗反流防御機制減弱和反流物攻擊食管黏膜，其中抗反流機制的削弱包括下食管括約肌功能失調、食管清除能力降低和食管黏膜屏障功能下降3種情況[3]。人體進食后，食物的機械性和化學性刺激導致胃酸分泌增加，引起機體胃酸增高或胃泌素分泌下降。若食管抗反流機制削弱，十二指腸和胃內容物極易反流進入食管，刺激、損傷食管黏膜，從而導致GERD的發生和發展[4]。GERD癥狀多樣，包括胃灼燒、反酸、胸骨后痛等典型癥狀和咳嗽、咽喉不適、噯氣、哮喘等非典型癥狀或者食管外表現[5]。診斷方法主要依靠質子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)試驗，胃鏡、喉鏡、造影，食管反流監測，高分辨率測壓等，但上述方法局限性大，大部分屬于侵入性操作，患者依從性欠佳，限制了疾病的及時診斷。因此需要尋找易于接受、非侵入性的檢測方法，提高GERD的檢出率。血液、痰、唾液或反流物檢測有操作簡便、費用低、檢出率高及病人檢查前后無不適反應，易于接受等優勢，有望成為未來GERD診斷的方向。本研究重點對潛在的新的診斷標記物發展和相關檢測技術發展現狀進行綜述。

1 GERD潛在的診斷標記物

1.1 胃蛋白酶原和胃蛋白酶

胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)屬天冬氨酸蛋白酶家族，由375個氨基酸構成，本身無活性，胃腔內胃酸可將其激活為具有生物活性的胃蛋白酶，進而水解蛋白質和多肽。人胃黏膜中包含7組胃蛋白酶同工酶原，其中PGI(PGA)由1～5組分組成，由胃底腺的主細胞分泌；PGII(PGC)由6～7組分組成，由全胃腺體和十二指腸的Brunnce腺細胞分泌[6]。PG由高爾基體分泌進入胃腔，然后少量PG通過毛細血管進入到血液循環，在血液中穩定存在[7]。

GERD患者反流物的成分主要有胃酸、胃蛋白酶、膽汁和胰酶等，其中胃酸和胃蛋白酶對食管黏膜的攻擊作用最為顯著[4，8]。①在GERD的發病過程中，PG由胃酸激活為有生物活性的胃蛋白酶，兩者反流至食管或咽喉黏膜，導致相應部位產生病理性損害，引起GERD癥狀[9]；②反流到食管或咽喉部的胃蛋白酶可長時間滯留于此，當再次發生酸反流時胃蛋白酶可恢復其活性，從而再次引發燒灼感癥狀；③國內外報道，GERD患者唾液中的PGI濃度超過健康人群，具有顯著性差異，可以作為標志物指導GERD的臨床診斷[10]；④研究發現反流性食管炎、慢性萎縮性胃炎及胃癌患者體內血清PG和PGR(胃蛋白酶原比值)的變化顯著，為診斷和評估病情提供重要價值[11]；⑤血清中PG含量聯合GerdQ評分可作為老年GERD治療后的隨訪指標，為患者提供一種敏感、無創的檢查手段[12]；⑥PG作為GERD的敏感性指標有一定的局限性，由于唾液的分泌受日間活動量、飲食習慣等多因素干擾，唾液中PG檢測準確性不如血清PG，導致其與疾病的相關性受到影響；⑦血清PG也受年齡、性別、幽門螺桿菌等因素影響，男性明顯高于女性，PGI與PGI/PGII比值在老年組明顯下降，PGII與年齡呈正相關[13]。故分析其結果時，均應思考上述影響因素。

胃蛋白酶是胃蛋白酶原經胃酸活化后形成的一類能夠水解蛋白質的消化性蛋白質。最初，唾液胃蛋白酶作為診斷GERD的指標被提出，隨后被多方報道驗證證實[14]。目前，胃蛋白酶已在多種樣本中檢測到，如喉黏膜、鼻竇黏膜、唾液、中耳滲出液、氣管分泌物以及肺泡黏膜灌洗液等，且已被證實與反流性疾病相關[15]。胃蛋白酶能準確反映患者咽喉反流情況，有無創、快速、準確、操作簡單及客觀性強等優點，已被提出作為檢測GERD的新方法。但對采集樣本的時機、胃蛋白測定的方法、濃度的診斷閾值和參考的診斷標準還未達成統一共識。

1.2 胃泌素

胃泌素(gastrin，GAS)是一種由G細胞分泌產生的胃腸道激素，具有促進胃腸道分泌，調節食管下括約肌張力等功能[16]。人血液循環中的GAS是由不同長度和不同序列的氨基酸多肽混合物組成，主要包含胃泌素G-34和胃泌素G-17兩種異構體[17]。胃泌素G-34主要存在于十二指腸黏膜內；而胃泌素G-17占所有有活性胃泌素的80%～90%，主要存在于胃竇黏膜內，可反映胃竇G細胞數量，與血清PG臨床作用相互補充[18]。研究發現，胃泌素可調節食管下端括約肌收縮，其分泌受胃酸含量控制，因此胃泌素與GERD存在密切關系，可輔助GERD的診斷治療[19]。

胃泌素在GERD臨床診斷中有一定局限性，血清G-17受幽門螺旋桿菌感染、性別、年齡、G細胞數量、胃內pH值、糖尿病和惡性貧血等多因素及疾病影響，引起臨床診斷指標的異常[20]。

1.3 細胞因子

近年來的研究發現，反流性食管炎并不從食管黏膜表面化學性損傷開始，而是從黏膜下層的淋巴細胞開始，逐漸發展到黏膜表面的損傷[21]。GERD相關的炎性細胞包括食管黏膜的淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞和多型核白細胞，同時還包括食管上皮細胞、血管內皮細胞等，這些細胞產生多種炎性因子，如白細胞介素-6(interleukin，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等[22]。

IL-6是由B細胞、單核-吞噬細胞、T細胞和血管內皮細胞等多種細胞分泌產生的糖蛋白，能夠誘導B細胞、單核細胞、T細胞等分化，調節機體的免疫防御機制。研究表明，與正常組對比，食管癌患者血清IL-6水平顯著升高，并且隨著食管癌等級的加深，血清IL-6水平呈現增長趨勢，同時研究發現術后恢復良好IL-6水平明顯降低[23]。研究發現，BE患者血清和食管組織中IL-6水平較正常組也明顯升高[24]。雖然BE患者缺少炎癥反應，但是在BE組織中Th2相關細胞因子表達升高。IL-6作為Th2型免疫應答的重要細胞因子，其水平增高激活信號轉導途徑，促進BE向腫瘤方向發展[25]。因此，血清IL-6可作為食管癌診斷、病情監測和預后判斷的一個有效輔助指標。

TNF-α由單核巨噬細胞產生，能夠介導機體免疫調節功能，參與炎癥反應過程，并能夠刺激中性粒細胞產生活性氧，與反酸時食管黏膜過氧化反應密切相關[26]。研究表明，TNF-α可激活NF-κB途徑，而后者是炎癥和癌癥發生過程中關鍵的調節信號分子，并且研究顯示在反流性食管炎演化為BE過程中TNF-α起到一定作用[27]。

除了多種細胞因子參與GERD的形成與發展外，血清血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)也參與GERD的形成。VIP是一種含多個氨基酸殘基的堿基多肽，存在胃腸道內的神經和內分泌細胞中，能夠促進腸道水和電解質分泌，并參與各種細胞因子產生，調節炎癥細胞功能。胃腸道上皮細胞中存在大量VIP的特異性受體，隨著血液中VIP水平增加，VIP與胃腸道上皮細胞受體結合增多，導致食管下括約肌張力下降，從而誘發GERD[28]。

GERD患者與健康人群相比，血清IL-6、TNF-α、VIP水平顯著升高。不同類型GERD患者中，炎性因子的水平不同，一般EE組最高，BE組次之，NERD組最低，表明糜爛性食管炎(erosive esophagitis，EE)患者食管括約肌受損相比較重，且機體存在明顯炎癥反應，治療過程中應密切注意，BE及NERD患者常為慢性食管黏膜損傷，導致炎癥反應相對較弱。

1.4 Claudin蛋白家族

緊密連接是維持細胞粘附的結構之一，可調節細胞的運動和功能，維持上皮組織結構的穩定。Claudin蛋白是組成緊密連接主要的骨架蛋白，與其他蛋白相互作用，維持緊密連接的結構和功能。Claudin蛋白表達異常，破壞緊密連接的完整，造成細胞粘附力下降，損害上皮組織屏障，引發多種疾病。目前發現Claudin蛋白家族的表達具有高度的組織特異性。研究表明Claudin 1、Claudin 3蛋白在食管鱗癌中顯著表達，而Claudin 4蛋白在食管鱗癌中較健康組無顯著性差異[29]。Claudin 4蛋白的表達主要聚集在腺體的緊密連接處，在BE和食管腺癌中異常高表達[30]。由此可見，Claudin蛋白家族有可能成為GERD的理想標志物和治療靶點，但Claudin蛋白家族的表達規律、表達異常的應用以及與GERD臨床的具體關聯需進一步研究。

1.5 膽汁酸

膽汁酸是膽汁中最主要的有機成分，膽汁酸引起食管黏膜損傷與其膜表面去污性相關。①膽汁酸具有親脂性，可溶解細胞膜脂質，引起細胞膜破壞，導致細胞損傷，能進入細胞內，使細胞內膽汁酸濃度過高，破壞細胞內膜系統，導致細胞壞死[31]；②膽汁酸鹽的刺激引起氧化應激、脂質過氧化反應、自由基的產生，導致氧化應激相關基因的表達、誘導DNA損傷[32]；③由于眾多基因和后生遺傳的蓄積，造成BE通過化生、不典型增生，最終導致癌變；④與健康人群對比，GERD患者胃液中膽汁酸水平顯著增高，且與胃黏膜損傷程度密切相關；⑤研究表明，在BE患者的食管中有更高濃度的膽汁酸(可比正常人高出10倍)，發生膽汁反流的患者比例高于其他組，BE患者中具有毒性的二級膽酸--去氧膽酸水平較其他GERD類型及消化不良患者高[33]。由此，膽汁酸可作為標志物，輔助GERD的診斷。

研究表明，膽汁酸的功能受pH值影響，在pH＞6的條件下，膽汁酸呈極性離子態，不易引起細胞損傷；在pH=3～5的條件下，膽汁酸呈無極性非離子態，極易破壞細胞和產生活性氧成分；在pH值＜3的環境中，膽汁酸沉淀，不引起食管損傷[34]。因此在治療GERD過程中，需要將pH環境因素思考在內，更加有效的控制GERD癥狀。

1.6 痰及支氣管肺泡灌洗液細胞學分析

胃食管反流性咳嗽是由于胃酸和其他胃內容物反流進入食管，引起的反射性咳嗽，其臨床癥狀主要為咳嗽、反酸、胸骨后灼燒感等，容易被誤診為其他呼吸道疾病。對于原因不明的胃食管反流性咳嗽患者做痰及支氣管肺泡灌洗液細胞學分析，有助于準確判斷患者病情。采集深部痰或灌洗液，液化后，圖涂片染色，顯微鏡下進行總細胞計數和分類。嗜酸性粒細胞增高，提示存在支氣管哮喘、嗜酸性粒細胞支氣管炎和過敏性疾病；中性粒細胞增高提示存在非哮喘性慢性咳嗽、胃食管反流性咳嗽。GRED患者治療前后的痰細胞進行比較發現，治療前主要是中性粒細胞和巨噬細胞，治療后中性粒細胞明顯減少，巨噬細胞和淋巴細胞數目升高。該方法學重復性好，與氣管黏膜活檢檢測結果的相關性較好，有助于病情、治療效果的診斷。

1.7 胃幽門螺旋桿菌

幽門螺旋桿菌(helicobacter pylori，HP)是一種主要存在于胃黏膜組織中的革蘭氏陰性微需氧螺旋形桿菌。HP利用自身的螺旋性特性，寄生于靠近胃黏膜上皮的粘液中，導致胃炎、胃潰瘍、甚至胃癌等疾病。目前，許多研究認為HP所致的胃部炎癥及炎癥刺激產生一些可抑制壁細胞產酸的因子；胃竇部HP感染引起胃泌素升高，提高食管下括約肌(low esophageal sphincte，LES)的壓力，加速胃排空和加快胃竇部的蠕動；HP產生氨和尿素酶，保護細菌，中和胃酸，從而導致HP感染能夠抑制GERD的發展[35]。

流行病學研究提示，HP感染與GERD之間有著相互制約的關系。在發達國家HP的感染率逐步下降，而GERD的發病率卻不斷上升；GERD患者中的HP感染發生率較對照組明顯降低[36]。臨床也有胃食管返流病在HP根除后發生率增加的調查報告[37]。HP的感染人群遠遠多于胃食管反流人群，并且HP的感染對胃酸分泌的影響存在不確定性(有可能增加、降低和保持不變)，因此通過檢測是否有HP感染可以指導和評估GERD患者的治療效果。對伴有HP感染和GERD發病的患者，需兼顧除菌和PPI治療。

2 相關臨床或實驗室診斷方法

PGI、PGII、胃泌素和細胞因子測定方法有多種，如免疫層析法、化學發光法、酶聯免疫吸附法和免疫比濁法等，其中PGI、PGII以免疫比濁法最常用，胃泌素、細胞因子以免疫層析法為主。

2.1 免疫層析法

免疫層析法是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細管作用，樣品沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，若用免疫膠體金、免疫酶或熒光物質標記，可使該區域顯示一定的顏色或熒光，從而實現特異性的免疫診斷。免疫層析成本低，操作簡便快速，不需任何附加設備，5～10 min即可出結果，適用于醫院、衛生防疫、診所和家庭等，主要用于定性檢測或半定量檢測。

2.2 化學發光法

化學發光法是用化學發光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。化學發光法檢測靈敏度高，自動化程度高，少量標本時相對簡便。但化學發光試劑多為非開放型，試劑價格較高。發展樣品小型化的化學發光儀用于即時檢驗(point of care testing，POCT)監測成為一個新的熱點和增長點。

2.3 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物后顏色變化，通過酶標儀對檢測樣品進行定量測定和分析，并用標準曲線對照計算出PGI含量。ELISA法具有高度的敏感性、特異性，且試劑比較穩定，無放射性污染，但存在操作復雜、耗時較長的缺點。

2.4 免疫比濁法

免疫比濁法是在一定量的抗體中分別加入遞增量的抗原，經一定時間后形成抗原抗體復合物，用濁度計測量反應液體的濁度，并由此推算樣品中的抗原含量。免疫比濁法按測試方法可分為透射比濁法和散射比濁法。透射比濁法主要通過檢測透射光強度測定抗原抗體復合物所形成的濁度，散射比濁法通過檢測散射光強度測定抗原抗體復合物所形成的濁度。與透射比濁法相比，散射比濁法能很好地解決鉤狀效應(Hook)對測試結果的影響。由于此方法為均相反應，反應速度較快，檢測時間短，臨床應用的場景比較廣泛，常用于特定蛋白分析儀和全自動生化分析儀，既可以用于POCT檢測，也可以適用于中心實驗室檢測。

3 其他病理分析方法

除上述體外診斷生物標記物外，GERD也可通過內窺鏡檢測等病理檢測技術進行輔助診斷。1999年全國反流性食管病研討會制定了胃食管病的內鏡診斷標準和內鏡分類診斷方法，包括Savary Millerl51、洛杉磯分類標準及日本RE分級標準等，但上述分類方法都有一定缺陷，分級比較籠統，靈敏度等問題亟待解決，以及病理組織分級診斷標準與胃鏡下診斷分級標準存在出入，待進一步研究和統一[38]。在組織病理學標記物上包括細胞間黏附分子、細胞間隙增寬等，組織電阻抗光譜法可通過內鏡孔道在內鏡檢查時快速測量食管黏膜完整性。褚傳蓮等[39]報道，共聚焦激光顯微內鏡對非糜爛性反流病微觀變化的診斷價值，可以清晰地觀察到食管黏膜上皮乳頭內毛細血管袢(intraepithelial papillary capillary loops，IPCLs)形態、管徑的變化及細胞間隙增寬，是一種新的非糜爛性反流病檢查方法。

4 展望

GERD是一種極易誤診的常見消化道疾病，存在多種非典型癥狀如咳嗽、哮喘、吞咽困難等，診斷存在較大困難。目前常用的檢測手段侵入性強、價格昂貴，且具有一定的誤診率，因此，需要一種簡便、有效及敏感性高的診斷技術。經過研究，胃蛋白酶原和胃蛋白酶、胃泌素、細胞因子、Claudin蛋白家族、膽汁酸等指標在GERD患者中具有明顯的分泌異常，可作為GERD診斷標志物。雖然目前這些GERD異常標志物依舊受多種因素影響，存在各自的局限性，但是有望成為今后GERD診斷發展方向。HP無法準確作為GERD診斷標志物，但HP指標在指導GERD治療至關重要。由于GERD患病率逐年增加和臨床癥狀的多樣性，各種篩查手段仍然需要大量試驗進行驗證，以提高GERD的診斷率。