腎安沖劑對阿霉素腎病綜合征大鼠Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白的影響

符逢春 ，林 輝 ，劉 彬 ，毛以林 ，瞿曉林

（1.湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是由許多疾病引起的，以腎小球基底膜通透性增加而發生的一組臨床癥候群，主要表現為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高度水腫、高脂血癥。隨著病情的發展，可導致腎小球硬化和腎間質纖維化，逐漸發展為終末期腎衰竭。研究NS發病機制和干預比較理想的動物是阿霉素腎病綜合征大鼠，同時也是探討藥物治療機制的很好的實驗［1］。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過度積累是NS腎小球硬化的重要標志，其中ECM的主要成分纖維連接蛋白（fibronectin，FN）和Ⅳ型膠原（collagen typeⅣ，Ⅳ-C）的含量明顯增加，腎小球內Ⅳ-C、FN的含量可直接反映腎小球硬化的程度［2］。本研究利用阿霉素腎病綜合征大鼠模型，采用免疫組化技術觀察腎安沖劑對該模型大鼠腎臟Ⅳ-C和FN表達的影響，為延緩腎小球硬化和腎間質纖維化的中醫藥治療提供客觀的實驗及臨床依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 Ⅳ-C、FN免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑，由武漢博士德生物工程有限公司提供；潑尼松片由昆明制藥集團有限公司生產；鹽酸阿霉素（多柔比星）由法瑪西亞普強有限公司生產；腎安沖劑由黨參、生黃芪、白術、山藥、芡實、升麻、柴胡、仙茅、淫羊藿、當歸、丹參、鳳尾草、山楂、甘草組成，由湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院藥劑科制作（8 g／包）。

1.2 動物 SD雄性大鼠72只，體重（250±20）g，中南大學實驗動物學部提供，許可證號：SCXK（湘）2014－0002，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物飼養室。

1.3 實驗動物分組及給藥方法 SD雄性大鼠72只隨機分為造模組共60只和正常對照組12只。阿霉素腎病綜合征大鼠模型的制作：依據文獻［3］，結合預試驗，造模組分兩次注射鹽酸阿霉素，第一天用阿霉素5 mg／kg注射于SD大鼠尾靜脈內，1周后再次注射阿霉素2 mg／kg于SD大鼠尾靜脈內，正常組也尾靜脈注射相應生理鹽水兩次。造模組大鼠再分為腎安沖劑大劑量組、中劑量組、小劑量組，模型組和潑尼松組，每組12只。各治療組從注射阿霉素2次后第2天起，每天早上8時一次性灌胃給藥，連續給藥8周。各組給藥劑量按人和大鼠體表面積換算法計算，腎安沖劑大劑量組、中劑量組和小劑量組分別灌服腎安沖劑 10.32 g／（kg·d）、5.16 g／（kg·d）、2.58 g／（kg·d）， 模型組灌服蒸餾水 2 mL／d，潑尼松組灌服潑尼松 6.45 mg／（kg·d），正常對照組灌服生理鹽水2 mL／d。

1.4 Ⅳ-C和FN的分布及檢測 采用免疫組化法。治療8周后處死大鼠，取腎臟石蠟切片，常規脫蠟至水，采用SABC法檢測腎組織中的Ⅳ-C和FN。10%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，用枸櫞酸鹽（pH＝6.0）微波修復；2%BSA封閉20 min。加一抗（FN，1∶100；Ⅳ-C，1∶100）37℃ 1 h，PBS（pH 7.2～7.6）洗3次；加二抗生物素化山羊抗小鼠IgG37℃ 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 3 次；加 SABC 復合物液孵育 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 4 次；DAB 顯色，蘇木紅復染，每次染色均以PBS代替一抗作陰性對照。顯微鏡下觀察并攝片，結果以細胞膜和細胞外基質中出現明顯的棕黃色反應為陽性。

1.5 結果判定 采用雙盲進行分析，每組切片隨機選取5個視野，用MIAS醫學圖像分析系統掃描進行統計分析，測量每一視野的陽性目標染色區域的平均灰度，取其平均數作定量分析。

1.6 統計學方法 用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量資料屬正態分布以（）表示，多組樣本間比較用F檢驗，組間比較用q檢驗。

2 結 果

2.1 6組Ⅳ-C和FN表達的平均灰度比較 見表1。用低倍顯微鏡和高倍顯微鏡下觀察切片，鏡下可見陽性細胞結構清晰，細胞漿內有棕黃色顆粒沉著，顆粒染色顯著高于背景。實驗過程中腎安沖劑小劑量組、中劑量組、大劑量組，模型組，潑尼松組分別有 4、3、2、2、3只大鼠死亡，均是由灌胃而導致死亡。

表1 6組Ⅳ-C和FN表達的平均灰度比較（）

表1 6組Ⅳ-C和FN表達的平均灰度比較（）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與腎安沖劑大劑量組比較，2） P＜0.01。

FN 87.23±11.341）171.64±13.06 142.62±13.381）2）131.37±21.701）2）112.16±13.041）144.81±16.671）2）組別正常對照組模型組腎安沖劑小劑量組腎安沖劑中劑量組腎安沖劑大劑量組潑尼松組n 12 9 8 9 1 0 9Ⅳ-C 80.07±14.91）154.5±18.4 132.6±15.61）2）123.6±18.51）2）102.7±22.01）128.0±14.01）2）

與模型組比較，各治療組腎臟Ⅳ-C和FN表達均明顯降低，說明腎安沖劑和潑尼松均有降低Ⅳ-C和FN表達的作用，而以腎安沖劑大劑量組療效最好。

2.2 Ⅳ-C表達的光鏡觀察 見圖1。正常對照組的陽性表達細胞極少，偶見陽性細胞的棕黃色顆粒，且染色較淺；模型組的陽性表達以棕黃色顆粒較多，且陽性細胞的棕黃色顆粒均較深，陽性表達以腎小球基底膜及腎小球系膜區較強；各治療組均可在一定程度上減輕陽性細胞的表達，腎安沖劑大劑量組的腎小球基底膜有少量細胞呈陽性表達，明顯比模型組少，陽性細胞的棕黃色顆粒染色深淺均勻，優于潑尼松組、腎安沖劑小劑量組和腎安沖劑中劑量組。

2.3 FN表達的光鏡觀察 見圖2。正常對照組的陽性表達細胞極少，偶見陽性細胞的棕黃色顆粒，且染色較淺；模型組的陽性表達以棕黃色顆粒較多，且陽性細胞的棕黃色顆粒均較深，于腎小球系膜細胞、血管內皮細胞及少量腎小管上皮胞漿均可見；各治療組均可在一定程度上減輕陽性細胞的表達，腎安沖劑大劑量組有少量細胞呈陽性表達，明顯比模型組少，陽性細胞的棕黃色顆粒染色深淺均勻，優于潑尼松組、腎安沖劑小劑量組和腎安沖劑中劑量組。

圖1 各組腎臟Ⅳ-C表達比較（×400）

圖2 各組腎臟FN表達比較（×400）

3 討 論

腎病綜合征屬中醫學的水腫范疇，為本虛標實證，其病機為虛、壅、漏，虛以脾腎氣陽虧虛為主，壅主要是水濕和瘀血，漏則表現為大量蛋白尿。腎安沖劑據此研制而成，方用生黃芪、淫羊藿溫補脾腎，益氣溫陽為君藥；仙茅助淫羊藿溫腎補陽，白術、黨參助生黃芪益氣健脾，芡實、山藥補脾益腎，共為臣藥；丹參、當歸、山楂活血化瘀為佐藥；柴胡、升麻升提清氣，鳳尾草引濕濁由下而出，甘草調和諸藥。前期的研究表明腎安沖劑可降低腎病綜合征患者的血脂、尿蛋白，升高血漿白蛋白，明顯改善腎功能，對腎病綜合征治療有效［4-5］。

Ⅳ-C是腎小球基底膜網狀結構的主要成分，在腎纖維化的進展中，隨著腎臟疾病發展，細胞外基質積聚增多跟Ⅳ-C的合成和分泌增多及降解減少有關，最終發展為腎小球硬化和間質纖維化［6］。有研究顯示腎小球纖維化過程中Ⅳ-C合成增加［7］。FN可激活炎癥細胞，最終促使腎間質的纖維化［8］。薛痕等［9］研究發現腎間質纖維化動物模型腎間質FN的表達增加，并隨時間遞增，而且與間質相對面積成正相關。也有研究表明無論是免疫性還是非免疫性損傷引起的腎小球硬化過程中，FN的變化都發生較早且明顯［10］。

本研究表明腎安沖劑可降低阿霉素腎病綜合征大鼠腎組織Ⅳ-C和FN的表達，從而可延緩該模型大鼠進展為腎纖維化，為中醫藥抗腎纖維化提供了客觀的實驗依據。