牛骨膠原低聚肽對術后小鼠傷口愈合作用初步探討

徐 騰，李 迪，李 林，王天星，劉欣然，李 勇

(北京大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，北京 100191)

機體的營養狀況是影響傷口愈合的重要因素之一[1-4]。外科手術后病人很容易陷入營養不良狀態，導致傷口愈合延遲[5]。因此，通過提供合理的臨床營養支持，達到預防和減輕營養不良、增強機體免疫力，進而促進術后傷口愈合至關重要。

牛骨膠原低聚肽(BCOPs，以下簡稱牛骨肽)提取自牛骨，是一種動物性生物活性肽。研究發現，低聚肽比單個氨基酸的吸收更有效，且能直接參與蛋白質的合成，提高機體對蛋白質的利用率[6]，具有促消化吸收、降膽固醇、增強免疫、降血壓、降血糖、抗肥胖、抗氧化、緩解疲勞等生理功能[7-8]。本研究采用牛骨肽作為干預物，通過建立模擬臨床的皮膚切口手術模型，探討BCOPs作為營養制劑在傷口愈合中發揮的作用，為尋找促進傷口愈合功能性保健食品及藥品的開發提供實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品

BCOPs，淡白色固體粉末，由北京天肽生物科技有限公司提供。經凱氏定氮儀測定器肽含量為92.77g/100g，酸溶蛋白含量為95.5g/100g。進一步經高效液相色譜儀分析其中游離氨基酸組成，可知氨基酸總量占2.73%，其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸較多。

1.2 主要試劑及儀器

4%水合氯醛、6mm打孔器、Adventurer TM 通用型分析天平，美國奧豪斯國際貿易有限公司；Eppendorf 高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；電熱恒溫水浴鍋，北京天林恒泰科技有限公司；正置熒光顯微鏡，NIKON E400。

1.3 實驗動物

雄性ICR小鼠180只，體重18～22g，購于北京大學醫學部實驗動物中心。自由飲食、飲水。飼養實驗室符合國標清潔級，溫度范圍25±1℃，相對濕度50%～60%，室內照明控制在12h/12h光暗周期節律。

1.4 實驗分組與處理

1.4.1實驗分組 經適應期喂養后，將180只小鼠隨機分為6組，設1個空白對照組和5個BCOPs劑量組(0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW)，分別對應BCOPs(0.375)、BCOPs(0.75)、BCOPs(1.5)、BCOPs(3.0)、BCOPs(6.0)，每組小鼠隨機分為3個亞組，每個亞組10只。

1.4.2皮膚切口手術模型建立 小鼠經4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用剃毛刀將背部毛發去除，使用碘伏與酒精消毒后，在距背部中線1cm的兩側分別切一個 1.5cm長的縱行切口，同時切開肌肉，深達腹腔，然后逐層縫合肌肉和皮膚，術后涂 2%碘酊，注射青霉素 G(1 000IU/g·BW)以防止感染，術后禁食6h，正常飲水。

1.4.3牛骨膠原低聚肽干預 將手術當天記為術后第0天(POD0)，術后6h進行受試物干預，每日經口灌胃給予受試樣品。空白對照組給予蒸餾水，BCOPs劑量組給予相應濃度受試物，灌胃量為1mL/100g，受試樣品給予時間為11d。實驗期間觀察實驗動物的一般情況，包括毛色、精神狀態、日常活動情況等。

1.5 皮膚切口抗張力強度檢測

術后第7、11天，沿切口垂直方向切取以切口為中線，寬為0.5cm、長為中線雙側各0.5cm并包含切口在內的皮膚組織，去除皮下脂肪組織，于長方形短邊以絲線縫合作為牽引線，將皮條放置在帶有張力感受器的裝置中間，張力感受器另一端鏈接于多功能生物信號采集系統，采用帶有游標卡尺的微調裝置手動逐漸拉伸皮條，記錄皮條被拉斷時的張力。測微尺測量皮膚的厚度，每平方毫米面積的張力即為切口的抗張力強度。

1.6 血清指標檢測

在術后第3、7、11天經內眥采血分批處死小鼠，留取血清。采用ELISA法測定血清PA、IL-10、TNF-α含量。

1.7 病理觀察

各組小鼠分別于術后3、7、11天于傷口處距切口邊緣0.3cm處取全層皮膚組織，用4%甲醛進行固定，保存后待做石蠟切片及HE染色。

1.8 統計方法

數據均以平均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著者進行方差齊性檢驗，方差齊者以LSD法對多組均數進行post-hoc分析，方差不齊者以Dunnett’s T3法對多組均數進行post-hoc分析。以P<0.05為差異顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 小鼠一般狀況

實驗期間各組小鼠無死亡，飲食、飲水正常，生長、活動未見異常，毛色、精神狀況未見異常；實驗期間小鼠體重在術后下降，隨后正常增長，與對照組相比無統計學差異(P>0.05)。

2.2 牛骨肽對皮膚切口抗張力強度的影響

在POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5)劑量組抗張力強度高于對照組，但是結果無統計學差異(P>0.05)；POD11，牛骨肽各劑量組小鼠抗張力強度均高于對照組，其中BCOPs(1.5)劑量組與對照組相比，抗張力強度結果具有統計學差異(P<0.05)(表1)。

2.3 牛骨肽對小鼠血清PA、IL-10、TNF-α含量的影響

POD3，除了BCOPs(6.0)劑量組小鼠血清PA濃度明顯低于對照組外(P<0.05)，其余各劑量組小鼠血清PA濃度均明顯高于對照組(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、1.5、6.0)劑量組小鼠血清PA濃度明顯低于對照組(P<0.05)；POD11，BCOPs(3.0)劑量組小鼠血清PA濃度明顯高于對照組；其余各劑量組則明顯低于對照組(P<0.05)(表2)。

組別抗張力強度(g/mm2)POD7POD11空白對照組22.51±1.7334.05±4.77BCOPs(0.375)27.58±3.9836.98±4.21BCOPs(0.75)25.69±6.5337.99±4.39BCOPs(1.5)23.46±3.5940.16±6.07aBCOPs(3.0)22.82±1.2937.58±3.02BCOPs(6.0)25.56±4.2436.20±2.40

注：a與對照組相比結果有明顯差異，P<0.05

組別血清PA濃度(μg/mL)POD3POD7POD11空白對照組31.62±2.7540.71±4.2139.98±3.32BCOPs(0.375)45.93±2.08a25.97±3.16a25.36±3.54aBCOPs(0.75)47.29±3.34a41.01±3.2620.61±3.87aBCOPs(1.5)39.71±3.17a35.17±4.04a28.67±4.09aBCOPs(3.0)36.68±3.13a42.13±4.2947.84±3.89aBCOPs(6.0)23.86±3.75a28.83±3.76a26.96±3.81a

注：a與對照組相比結果有明顯差異，P<0.05

POD3，BCOPs(0.375、0.75)劑量組小鼠血清IL-10濃度明顯大于對照組(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5)劑量組小鼠血清IL-10濃度明顯大于對照組(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.75、1.5、3.0、6.0)劑量組小鼠血清濃度明顯大于對照組(P<0.05)(表3)。

組別血清IL-10濃度(pg/mL)POD3POD7POD11空白對照組508.07±70.39533.71±86.23499.31±75.09BCOPs(0.375)901.18±101.05a633.29±82.11a498.37±66.53BCOPs(0.75)825.55±114.94a710.37±56.71a569.32±73.90aBCOPs(1.5)899.85±94.80632.43±85.35a743.78±73.26aBCOPs(3.0)625.79±62.26454.28±77.67700.89±94.40aBCOPs(6.0)512.92±49.37595.06±74.14590.23±47.65a

注：a與對照組相比結果有明顯差異，P<0.05

POD3，BCOPs(6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度明顯低于對照組(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5、6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度均明顯低于對照組(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.375、0.75、3.0、6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度均明顯低于對照組(P<0.05)(表4)。

組別血清TNF-α濃度(ng/L)POD3POD7POD11空白對照組498.29±46.91625.99±69.02611.05±65.08BCOPs(0.375)400.54±97.34515.31±84.31a501.99±56.12aBCOPs(0.75)503.99±41.71456.88±59.89a365.92±58.41aBCOPs(1.5)461.23±79.06518.22±64.51a570.31±52.09BCOPs(3.0)590.36±71.59594.22±97.76318.58±64.29aBCOPs(6.0)345.54±23.87a377.74±53.47a535.95±54.18a

注：a與對照組相比結果有明顯差異，P<0.05

2.4 組織病理學觀察

圖1～3分別為皮膚切口手術模型小鼠在術后3、7、11d時的HE染色結果。POD3，鏡下可見對照組表皮連接，真皮層斷裂，依稀可見炎性細胞；各劑量組表皮連接，且表皮層厚度較對照組高，傷口處可見炎性細胞浸潤，BCOPs(0.375、1.5、3.0)劑量組可見真皮層連接。POD7，對照組表皮層增厚，真皮層斷裂，而各劑量組真皮層均已連接，BCOPs(0.375、0.75)劑量組可見炎性細胞浸潤，BCOPs(1.5、3.0、6.0)劑量組可見纖維母細胞分化增生，膠原排列不整齊；BCOPs(3.0、6.0)鏡下可見血管增生；POD11，對照組表皮層與真皮層均已連接，鏡下可見纖維母細胞和毛細血管，BCOPs(0.375、0.75)劑量組可見毛囊等附屬器官，膠原、排列趨于整齊，BCOPs(1.5、3.0、6.0)劑量組愈合良好，傷口處與正常組織相差不大。

3 討論

正常的傷口愈合包括3個時期，即炎癥期、增生期和修復期[9-11]。本實驗以蒸餾水組作為空白對照，采用皮膚切口手術模型，模擬臨床Ⅰ期愈合方式，觀察牛骨肽對小鼠術后傷口愈合的促進作用。抗張力強度可以反映新生成的皮下膠原纖維在分子層面上的連接能力，是衡量傷口愈合狀況的一個重要指標[12]。本實驗選擇在傷口愈合的第7天和第11天測量小鼠術后傷口愈合的抗張力強度，是因為此時基本處于傷口愈合的增生期和瘢痕期，在此時期，包括纖維母細胞分化、血管生成、膠原纖維形成等一系列變化，傷口具有一定的張力。從實驗結果來看，術后第7天，各劑量組抗張力強度與對照組之間無明顯差異，但是其均值均大于對照組；術后第11天，BCOPs(1.5)劑量組小鼠皮膚抗張力強度明顯大于對照組，提示了皮膚愈合良好，此劑量組對于傷口愈合具有明顯的促進作用。其他劑量組與對照組相比雖然無明顯差異，但是均值均大于對照組，顯現出傷口愈合良好的趨勢。

術后對于機體進行必要的營養支持，有利于機體的快速恢復[13]。血清PA具有半衰期短、代謝迅速、特異性和敏感性強的特點，其血清中的濃度與營養狀況的早期變化密切相關，可反映人體臟器蛋白質含量狀況，是評價和監測患者營養狀態的金標準[14-15]。術后第3天，BCOPs(0.375)、BCOPs(0.75)、BCOPs(1.5)、BCOPs(3.0)劑量組小鼠血清PA濃度明顯高于對照組，提示此時機體營養狀況良好，此劑量牛骨肽可通過促進PA的表達使小鼠保持良好的營養狀態；同時多個劑量組血清ALB濃度明顯高于對照組，進一步證明牛骨肽對于術后小鼠的蛋白營養作用。由于PA屬于急性時相反應蛋白，半衰期較短，因此，隨著術后時間的推進其濃度降低。而其在術后第7天和第11天濃度明顯低于對照組的情況，推測可能的原因是由于傷口愈合進程加快，導致組織修復消耗了大量的能量。

圖1 皮膚切口手術模型小鼠皮膚組織POD3組織形態(HE染色，200×)

圖2 皮膚切口手術模型小鼠皮膚組織POD7組織形態(HE染色，200×)

圖3 皮膚切口手術模型小鼠皮膚組織POD11組織形態(HE染色，200×)

白介素10(IL-10)是一種抗炎性細胞因子。 IL-10可以不依賴于其對抗原呈遞細胞的抑制而直接作用于T細胞。在中性粒細胞中，IL-10能抑制炎癥介質的產生，從而抑制由脂多糖和吞噬細菌引起的腫瘤壞死因子 TNF-α及 IL-1β的產生[16]。此外，IL-10能抑制各種趨化中性粒細胞化學因子釋放，也能夠抑制環氧合酶-2和前列腺素E2的合成。在嗜酸性粒細胞中，IL-10能抑制脂多糖引起的各種炎性介質(如 TNF-α等)的產生，進而避免了炎癥反應的發生[17]。本實驗中，除了術后第7天時BCOPs(3.0)劑量組IL-10濃度小于空白對照組外，其余時期牛骨肽劑量組IL-10濃度均大于對照組，提示牛骨肽通過促進IL-10的表達抑制炎癥反應。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在創傷愈合中的主要作用是炎性細胞滲透[18]，并且TNF-α具有雙重生物學效應，濃度較低時主要作為白細胞和內皮細胞的自分泌及旁分泌的調節物質，可以抵抗細菌、病毒和寄生蟲的感染，促進組織修復，調節炎癥反應，引起腫瘤細胞凋亡等；高濃度時，過量的TNF-α則會破壞機體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產生多種病理損傷[19-20]。POD3，BCOPs(6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度明顯低于對照組(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5、6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度均明顯低于對照組(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.375、0.75、3.0、6.0)劑量組小鼠血清TNF-α濃度均明顯低于對照組(P<0.05)，提示牛骨肽可通過下調TNF-α的表達促進組織修復，其具體的通路可能與IL-10的表達增加有關。

除以上證據外，病理觀察結果也同樣提示牛骨肽劑量組傷口愈合情況優于空白對照組。因此，筆者認為牛骨肽可在術后早期提供充分的營養支持，并且其可抑制IL-10和TNF-α的表達以促進傷口愈合。

4 結論

本研究通過建立小鼠傷口模型，探討BCOPs對于傷口愈合是否具有促進作用。結果表明，牛骨肽可以有效促進小鼠傷口愈合，這一方面是因為牛骨肽可通過術后早期營養支持使機體具有充足的組織修復的能量，另一方面與牛骨肽抑制炎癥因子的表達有關。由于傷口愈合是一個復雜的過程，BCOPs對于促進傷口愈合的具體機制仍有待進一步研究。◇