HPLC法同時測定小兒退熱口服液中四種目標成分

馮葉彬

小兒退熱口服液主要由大青葉、板藍根、金銀花、梔子、牡丹皮、黃芩、連翹、淡竹葉等十二味中藥組成[1]，具有疏風解表、解毒利咽的功效，用于小兒外感風熱所致的感冒[2]。其中金銀花的主要藥效活性成分為綠原酸，梔子的主要藥效活性成分為梔子苷，牡丹皮的主要藥效活性成分為丹皮酚，黃芩的主要藥效活性成分為黃芩苷[3-6]。2015版《中國藥典》分別對梔子苷和黃芩苷進行含量測定[7]，而對綠原酸和丹皮酚僅進行了薄層鑒別，對于小兒退熱口服液的質量控制方法有待進一步提高。目前有報道分別測定不同制劑中綠原酸、丹皮酚、黃芩苷、梔子苷的含量[8-11]，但能夠同時對這4種成分進行測定的報道較少，為進一步提高藥品有效成分含量的穩定度，提高藥品質量，本文通過HPLC梯度洗脫體系，同時測定樣品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚的含量，建立了小兒退熱口服液中四種目標成分含量測定的HPLC方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀；Milli-QA超純水器（Millipore），METTLER TOLEDO XS205分析天平。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號：110753-201314）（中國藥品生物制品檢定所）、梔子苷對照品（批號：110749-200512）（中國藥品生物制品檢定所）、黃芩苷對照品（批號：110725-201321）（中國藥品生物制品檢定所）、丹皮酚對照品（批號：110708-200506）（中國藥品生物制品檢定所），甲醇為色譜純（默克公司），蒸餾水，其余使用試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。小兒退熱口服液（批號：14263934、15260262、14263933，廠家：北京同仁堂科技發展股份有限公司）。

2 方法

2.1 含量測定

色譜條件：色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫梯度見表1）；檢測波長：綠原酸為330 nm，梔子苷為240 nm，黃芩苷、丹皮酚為278 nm；流速：1 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μl；理論板數按丹皮酚峰計算應不低于5 000，詳見表1。

2.2 對照品溶液制備

分別取綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚對照品適量，進行精密稱定，用50%甲醇溶解，最后制備成每毫升含綠原酸10 μg、梔子苷50 μg、黃芩苷50 μg、丹皮酚10 μg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

用移液管精密量取小兒退熱口服液供試品1 ml，倒入25 ml容量瓶，用50%甲醇逐步適量稀釋定容至所需刻度，充分搖勻，緩慢濾過，取續濾液，即得小兒退熱口服液供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

根據小兒退熱口服液處方的比例制備缺乏綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚的陰性樣品，將陰性樣品按照“2.3”項下的制備方法配置成陰性樣品溶液。

2.5 標準曲線制備

分別精密量取綠原酸（0.034 58 mg/ml）、梔子苷（0.243 12 mg/ml）、黃芩苷（0.339 67 mg/ml）、丹皮酚（0.050 36 mg/ml）的對照品儲備液 0.1、0.2、0.5、1、2、5 ml，置于10 ml量瓶中，用50%甲醇逐步稀釋至所需刻度，充分搖勻，分別精密吸取10 μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚峰面積，以對照品峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。

表1 洗脫梯度

表 2 回歸方程與線性范圍

圖1 小兒退熱口服液含量測定高效液相色譜圖

3 結果

3.1 專屬性試驗

分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，注入高效液相色譜儀進行測定；圖1結果顯示：供試品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚色譜峰與其他雜質峰達到基線分離，表明陰性樣品溶液無干擾。

3.2 線性關系考察

按照方法項下2.5操作，線性范圍與回歸方程見表2。

3.3 精密度試驗

同一對照品溶液精密吸取10 μl，連續重復進樣6次，結果顯示綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.43%、0.20%、0.42%和0.10%，表明本法精密度良好。

3.4 穩定性試驗

分別量取已制備的小兒退熱口服液供試品溶液，室溫放置，并于第0、2、4、8、12、24 h進樣來測定峰面積，結果顯示綠原酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚RSD分別為0.10%、0.69%、0.55%、1.24%，表明小兒退熱口服液供試品溶液在24 h內非常穩定。

3.5 重現性試驗

分別量取6份同一批樣品（批號：15260262，廠家：北京同仁堂科技發展股份有限公司），嚴格按照含量測定下方法對樣品進行平行測定，結果為：綠原酸含量為0.355 0 mg/ml（RSD=0.52%），梔子苷含量為1.811 5mg/ml（RSD=1.12%），黃芩苷含量為1.851 6 mg/ml（RSD=1.49%），丹皮酚含量為0.157 8 mg/ml（RSD=0.49%），表明該方法測量樣品的重現性良好。

3.6 回收率試驗

用量筒精密量取已知含量的樣品0.5 ml（批號：15260262，廠家：北京同仁堂科技發展股份有限公司），共取6份，分別精密加入對照品溶液（綠原酸0.176 3 mg/ml、梔子苷0.911 15 mg/ml、黃芩苷0.916 7 mg/ml、丹皮酚0.072 4 mg/ml）1 ml，按照制備供試品溶液的方法進行制備，平行測定，計算回收率。結果見表3。

表3 回收率試驗結果（n=6）

3.7 樣品含量

量取“2.3”項下3個批號的小兒退熱口服液供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件分別進行測定，并記錄峰面積，按外標法計算各批次樣品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷和丹皮酚的含量。測定結果：批號為14263934、15260262、14263933的3批樣品中綠原酸含量分別為0.205 8 mg/ml、0.355 0 mg/ml、0.214 2 mg/ml，梔子苷含量分別為1.568 9 mg/ml、1.811 5 mg/ml、1.602 6 mg/ml，黃芩苷含量分別為2.158 6 mg/ml、1.851 6 mg/ml、2.178 0 mg/ml，丹皮酚含量分別為0.258 0 mg/ml、0.157 8 mg/ml、0.258 0 mg/ml。

4 討論

4.1 色譜條件的選擇

丹皮酚和梔子苷一般采用甲醇-水體系進行分離系統，黃芩苷與綠原酸一般采用甲醇-磷酸緩沖鹽體系進行分離。實驗發現綠源酸、梔子苷、黃芩苷、丹皮酚四種成分在甲醇-磷酸鹽緩沖體系中均峰形良好。通過考察不同比例磷酸（0.1%、0.2%、0.3%，0.4%），發現濃度為0.2%時峰形對稱，理論塔板數較好。由于小兒退熱口服液處方藥味較多，成分比較復雜，黃芩苷與丹皮酚峰比較接近，較難分離，故采用梯度洗脫方法[12-13]。

4.2 檢測波長的確定

采用Agilent工作站的DAD檢測器來進行全波長掃描，發現綠原酸在330 nm，梔子苷在240 nm，黃芩苷和丹皮酚在278 nm波長處有最大吸收。故選擇330 nm測定綠原酸，240 nm測定梔子苷，278 nm測定丹皮酚。

4.3 供試品制備

由于小兒退熱口服液已經經過水提和醇提過程，且目標成分均為水溶性成分，只需要簡單的稀釋即可進行測定。實驗證明此方法簡單可靠，操作性高。

本實驗結果表明本文建立的HPLC方法簡單、準確、靈敏，重現性好，適用于小兒退熱口服液的質量控制。