建立5種醫(yī)院制劑微生物限度檢查法

吳宏揚(yáng) 袁巍

《中國藥典》2015年版頒布執(zhí)行后，藥品微生物限度檢查法在檢查內(nèi)容、檢查方法、培養(yǎng)體系等方面都發(fā)生了很大變化。本文對(duì)我轄區(qū)內(nèi)五種醫(yī)院制劑芪穹止痛膠囊、平喘膠囊、芪蛤止哮膠囊、仙芪生血顆粒、羚黃凉血顆粒，根據(jù)《中國藥典》2015年版四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查（通則1106）、非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107）[1]進(jìn)行微生物限度檢查方法的驗(yàn)證研究，并且考察兩種稀釋劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，建立其完善的微生物限度檢查法，以確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，更好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量安全性和穩(wěn)定性。

1 儀器材料

1.1 儀器

立式高壓蒸汽滅菌器（型號(hào)：LDZX-75KBS廠家：上海申安醫(yī)療器械廠），生物安全柜（型號(hào)：BHC-1300ⅡA型 廠家：蘇凈集團(tuán)），恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：IPP110 PLUS廠家：德國美墨爾特）電子天平（型號(hào)：pl1002e廠家：梅特勒-托利多）一次性預(yù)滅菌平皿（廠家：北京陸橋）。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1 51230），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151219），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：150916），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151228），腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151204），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151124）麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151204）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151217）、RV沙門菌增菌液液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151206）、木糖賴氨酸脫氧膽酸瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151210），廠家均為北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]（產(chǎn)品號(hào)33025）、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]（產(chǎn)品號(hào)：33031）、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]（產(chǎn)品號(hào)：33034）、白色念珠菌[CMCC（F）98001]（產(chǎn)品號(hào)：33045）、黑曲霉[CMCC（F）98003]（33062）（33028）、沙門氏菌[CMCC（B）50001]（33027）廠家均為北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 稀釋液及沖洗液

pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：150518）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151228）廠家均為北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.5 樣品

芪穹止痛膠囊、平喘膠囊、芪蛤止哮膠囊、仙芪生血顆粒、羚黃凉血顆粒各3批。

2 方法與結(jié)果

按照《中國藥典》2015年版四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）和非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）的有關(guān)規(guī)定，對(duì)上述樣品進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

2.1 試驗(yàn)用菌液體制備

按照菌株產(chǎn)品使用說明書，將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、沙門氏菌球，分別用復(fù)溶液復(fù)溶后，稀釋至小于100 cfu/ml備用。

2.2 供試品制備

分別稱取各個(gè)樣品10 g，分別置pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各100 ml中，制成1：10供試品液。再稀釋成1：100和1：1 000供試品液備用。

2.3 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 需氧菌總數(shù) 平皿法：試驗(yàn)組：各取1：10供試品液10 ml，于滅菌試管中，加入相應(yīng)試驗(yàn)菌液0.1 ml使其最終濃度為每1 ml不大于100 cfu菌液，混勻，從試管中吸取1 ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨培養(yǎng)基，待凝固，倒置，每株試驗(yàn)菌株平行制備2個(gè)平皿，在30℃培養(yǎng)5天，測定計(jì)數(shù)，作為試驗(yàn)組菌落數(shù)。

菌液對(duì)照組：以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基10 ml分別代替供試品，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液，混勻，同法每株菌制備2個(gè)平皿，在30℃培養(yǎng)5天，測定計(jì)數(shù)，作為菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

供試品對(duì)照組：取制備好的1：10供試品液10 ml，以相應(yīng)稀釋液0.1 ml代替試液菌液，按照試驗(yàn)組操作，測定計(jì)數(shù)，作為供試品對(duì)照組菌落數(shù)。

表1 五種醫(yī)院制劑的需氧菌分析

表2 五種醫(yī)院制劑的菌液分析

分別按照公式：（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組的平均菌落數(shù)=回收率[2]，結(jié)果見表1。

2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù) 平皿法：

試驗(yàn)組：吸取相應(yīng)需氧菌總數(shù)供試品試驗(yàn)組供試液1 ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待凝固[3]，每株試驗(yàn)菌株平行制備2個(gè)平皿，在25℃培養(yǎng)7天，測定計(jì)數(shù)，作為試驗(yàn)組菌落數(shù)。

菌液對(duì)照組：以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基10 ml分別代替供試品，按需氧菌總數(shù)試驗(yàn)組操作加入相應(yīng)試驗(yàn)菌液[4-6]，混勻，同法每株菌制備2個(gè)平皿，在25℃培養(yǎng)7天，測定計(jì)數(shù)，作為菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

供試品對(duì)照組：制備好的1：10供試品液10 ml，以相應(yīng)稀釋液0.1 ml代替試液菌液，按照試驗(yàn)組操作，測定計(jì)數(shù)，作為供試品對(duì)照組菌落數(shù)。

按照公式：（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組的平均菌落數(shù)=回收率，結(jié)果見表2。

2.3.3 控制菌檢查 耐膽鹽革蘭氏陰性菌：分別取培養(yǎng)后的1：10供試液各1 ml，大腸埃希菌菌懸液1 ml及銅綠假單胞菌菌懸液1 ml，加至10 ml的腸道增菌液培養(yǎng)基中，按耐膽鹽革蘭氏陰性菌的檢查法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

大腸埃希菌：各取1：10供試品液10 ml及大腸埃希菌菌懸液1 ml，加至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，按照相應(yīng)的控制菌項(xiàng)下檢查法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

沙門菌：取供試品10 g，接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入沙門氏菌菌懸液1 ml，混勻，按照沙門菌項(xiàng)下檢查法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

結(jié)果：五種樣品的三種控制菌均用常規(guī)法檢出。

3 討論

由2.3項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果表明，五種醫(yī)院制劑均可采用平皿方法進(jìn)行需氧總數(shù)，霉菌和酵母菌總數(shù)檢驗(yàn)。耐膽鹽革蘭氏陰性菌、大腸埃希菌[7-10]、沙門菌等控制菌檢查均可采用常規(guī)方法進(jìn)行檢測。

《中國藥典》2015年版藥典實(shí)施后，稀釋液種類由原來的基礎(chǔ)上增加了胰酪大豆液體培養(yǎng)基，本驗(yàn)證試驗(yàn)方法對(duì)pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和胰酪大豆液體培養(yǎng)基兩種稀釋液進(jìn)行了對(duì)比考察，試驗(yàn)表明使用兩種稀釋液對(duì)上述五種供試品的檢驗(yàn)結(jié)果均無影響。從實(shí)際操作中看，使用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋液，更有利于實(shí)驗(yàn)步驟的簡化，方便后續(xù)控制菌檢查的開展，微生物計(jì)數(shù)與控制菌檢查第一步可以同時(shí)進(jìn)行，減少供試品的使用量和檢驗(yàn)周期，增加工作效率。

《中國藥典》2015年版藥典實(shí)施后，微生物計(jì)數(shù)改為需氧菌總數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)，用選擇性相對(duì)低的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基替代營養(yǎng)瓊脂，沙氏瓊脂培養(yǎng)基替換選擇性相對(duì)強(qiáng)的玫瑰紅鈉瓊脂，按微生物培養(yǎng)條件分類，需氧菌總數(shù)指在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的全部菌落數(shù)，包括真菌菌落數(shù)；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂上生長的所有菌落數(shù)，包括細(xì)菌菌落數(shù)。這樣修改避免了實(shí)驗(yàn)者區(qū)分細(xì)菌和酵母菌霉菌，能有效減少實(shí)驗(yàn)室之間，檢驗(yàn)者之間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成誤差，減少人為因素，更能真實(shí)體現(xiàn)樣品污染程度。

控制菌檢查項(xiàng)目將大腸菌群改為耐膽鹽革蘭氏陰性菌，并采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌，增加預(yù)增菌過程。使用無選擇性的增菌培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)后，可以使受損傷的細(xì)菌得到修復(fù)，從而提高檢出率，降低誤檢和漏檢。

驗(yàn)證方法中采用供試品溶液中加入試驗(yàn)菌[11-13]，且方法回收率改為0.5～2，合理考慮各方面的影響，符合微生物生長的習(xí)性，降低了回收試驗(yàn)的難度，使驗(yàn)證試驗(yàn)和檢驗(yàn)方法更簡便可靠。