雙波長(zhǎng)HPLC同時(shí)測(cè)定八角蓮中4′-去甲基鬼臼毒素鬼臼毒素 槲皮素 山柰素的含量

鐘水生，顧炳仁，周堅(jiān)，張華鋒，王亞瓊，郝剛

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215100)

八角蓮為小檗科植物八角蓮Dysosmaversipellis(Hance)M.Cheng ex Ying或六角蓮Dysosmapleiantha(Hance) Woods.等八角蓮屬多種植物的根或根莖，別名鬼臼，是我國(guó)傳統(tǒng)的民間常用藥之一，其已被多個(gè)地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)所收載，其中江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2016年版)收載的八角蓮為植物六角蓮Dysosmapleiantha(Hance) Woods的干燥根及根莖。具有清熱解毒、化痰散結(jié)、祛瘀消腫等功能。常用于癰腫療瘡、涼癰、咽喉腫痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，八角蓮還具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用[2]。現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)八角蓮中的化學(xué)成分進(jìn)行了研究報(bào)道[3]，八角蓮中的化學(xué)成分主要為兩類，一類為木脂素類，其中以鬼臼毒素和4′-去甲基鬼臼毒素為代表，另一類成分為黃酮類成分，以槲皮素和山柰素為代表。藥理研究表明，鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素具有抗腫瘤作用，并展現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制P388淋巴白血病細(xì)胞的作用[4]，而黃酮類成分槲皮素也被報(bào)道具有抗腫瘤、抗氧化、抗血栓、抗糖尿病及保護(hù)心血管和止瀉等方面的藥理作用[5]。

當(dāng)前，對(duì)八角蓮中木脂素類成分或黃酮類成分的測(cè)定均有報(bào)道[6-14]，但大多局限于單一類別有效成分的測(cè)定[6-9]。徐怡等[11]測(cè)定了八角蓮中槲皮素、山柰素和鬼臼毒素的含量，但其采用的檢測(cè)波長(zhǎng)為鬼臼毒素的最大吸收波長(zhǎng)290 nm，這一定程度上限制了八角蓮中低含量的黃酮類成分的檢測(cè)靈敏度。相關(guān)研究[12-14]分別采用高效液相色譜-二極管陣列-電化學(xué)聯(lián)用技術(shù)或超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測(cè)定了八角蓮中活性成分含量，相較于高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)，該法并不適用于在眾多實(shí)驗(yàn)室的普及。為增加靈敏度，并改善八角蓮中多組分質(zhì)量控制方法的普及性，本實(shí)驗(yàn)以植物六角蓮來源的八角蓮藥材為研究對(duì)象，探索了采用HPLC雙波長(zhǎng)法，對(duì)八角蓮中木脂素類代表成分鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素和黃酮類代表成分山柰素、槲皮素進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。經(jīng)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性良好，適用于八角蓮中活性成分的同時(shí)測(cè)定，從而為完善八角蓮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Waters 2698型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA紫外檢測(cè)器及Empower工作站。

1.2 試藥

對(duì)照品鬼臼毒素(批號(hào)：200602，純度100%)、4′-去甲基鬼臼毒素(批號(hào)：200901，純度：100%)、槲皮素(批號(hào)：201310，純度：93.2%)、山柰素(批號(hào)：201408，純度：99.1%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

八角蓮由蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心中藥室張華鋒主任鑒定為六角蓮Dysosmapleiantha(Hance)Woods的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

DIKMA C18Plus色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸(50∶50)；檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm(鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素)和360 nm(槲皮素、山柰素)；柱溫為35 ℃；流速為1 mL·min-1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含0.5、0.5、0.05、0.05 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取八角蓮粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，水浴回流1 h，放冷，再稱定重量，以40%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性

取2.2.1、2.2.2項(xiàng)下的溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1。各色譜峰之間分離良好，相互之間不存在干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素和山柰素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為147.20、480.80、43.17、51.14 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液2、5、8、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X，μg)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程，4′-去甲基鬼臼毒素：Y=6.464 6×105X-250.5，r=0.999 4；鬼臼毒素：Y=5.998 7×105X-509.6，r=0.999 3；槲皮素：Y=4.012 3×106X-526.3，r=0.999 3；山柰素：Y=4.253 1×106X-624.5，r=0.999 2。

結(jié)果表明，4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素、山柰素分別在進(jìn)樣量0.294 4～3.68、0.961 6～12.02、0.086 3～1.079 3、0.102 3～1.279 μg與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果4個(gè)組分的RSD在0.5～0.7%，均小于2%，表明精密度良好。

注：A.混合對(duì)照品；B.八角蓮樣品。圖1 混合對(duì)照品和八角蓮樣品分別在290 nm和360 nm下的色譜圖

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為20150817的八角蓮樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下操作制得供試品溶液，并進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算所測(cè)4個(gè)組分的各自含量及RSD，結(jié)果所測(cè)組分的RSD分別為1.4%、0.9%、1.5%、1.6%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為20150817的八角蓮樣品3份，按2.2.2項(xiàng)下操作制得供試品溶液，于室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h各進(jìn)樣一次，考察4種組分各自峰面積的一致性，結(jié)果表明，各組分的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的批號(hào)為20150817的八角蓮樣品(含4′-去甲基鬼臼毒素為11.26 mg·g-1、鬼臼毒素為16.9 mg·g-1、槲皮素為1.76 mg·g-1，山柰素為2.40 mg·g-1)9份，每3份為一組(高、中、低)，每份0.25 g，各組中分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液，混勻，揮干，按2.2.2項(xiàng)下操作，在2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1 4個(gè)組分的回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.9 樣品測(cè)定

取4批八角蓮樣品，按2.2.2項(xiàng)下操作，制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，并采用外標(biāo)法計(jì)算4個(gè)組分各自的含量，結(jié)果見表2

表2 八角蓮樣品中4個(gè)組分含量的測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素、槲皮素和山柰素各自的對(duì)照品溶液分別進(jìn)行紫外全掃描分析，結(jié)果顯示4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素的最大吸收波長(zhǎng)在290 nm左右，而槲皮素、山柰素的最大吸收波長(zhǎng)在360 nm左右。故初選290 nm和360 nm兩個(gè)波長(zhǎng)分別作為木脂素類成分和黃酮類成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。取八角蓮供試品溶液，按初選波長(zhǎng)在甲醇-0.1%磷酸溶液(50∶50)流動(dòng)相條件下進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果290 nm的色譜圖顯示，在槲皮素的色譜峰位置處不光有槲皮素的色譜峰，也有一小未知峰，且未能實(shí)現(xiàn)基線分離，呈現(xiàn)肩峰，但在360 nm檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，槲皮素的色譜峰位處的峰形尖銳，未出現(xiàn)肩峰。后期進(jìn)一步調(diào)試流動(dòng)相比例，以使干擾峰與色譜峰達(dá)到分離，但分離后，樣品分析時(shí)間顯著延長(zhǎng)，而對(duì)分離出的未知峰進(jìn)行全掃描分析發(fā)現(xiàn)，該未知峰在360 nm處并無(wú)吸收，說明該未知共有峰在360 nm下并不影響槲皮素的定量，為縮短分析時(shí)間，故最終仍選用甲醇-0.1%磷酸溶液(50∶50)作為八角蓮中4個(gè)組分同時(shí)測(cè)定的流動(dòng)相，此流動(dòng)相既保證了未知共有峰不干擾定量的準(zhǔn)確性，又縮短了分析時(shí)間，增大了分析通量。

3.2 樣品制備方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中分別考察了甲醇、乙醇、甲醇水溶液、乙醇水溶液作為提取溶劑，超聲處理和回流提取兩種提取方式對(duì)各組分提取的影響，結(jié)果顯示，超聲處理和回流提取對(duì)木脂素類成分的提取回收率影響不大，簡(jiǎn)單的超聲處理就能使木脂素類物質(zhì)提取完全。而對(duì)于黃酮類成分，采用簡(jiǎn)單的超聲處理難以使它們提取完全，需采用相對(duì)劇烈的回流提取方式。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)40%乙醇溶液的回流提取1 h能保證4個(gè)成分均能提取完全。故最終確定以40%乙醇為溶劑，回流提取1 h作為八角蓮的預(yù)處理方法。