基于組分配伍探討黃連 黃芩保肝的物質基礎△

段玉紅，蘇虹霞，楊紅蓮

(陜西中醫藥大學 附屬醫院 內分泌二科，陜西 咸陽 712000)

現在隨著藥物種類的不斷增多，藥物性肝病的發生也逐年增加。對乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)也叫撲熱息痛，為臨床常用解熱鎮痛藥，在大多數國家是非處方藥，為經典的解熱鎮痛藥[1]，在正常劑量服用是安全的，然而大劑量服用時會導致肝毒性。APAP成藥規格不同、種類多，包括多種復方制劑，在使用和銷售過程中都比較隨意，造成大量的不良反應。其中比較嚴重、不能忽視的是APAP對肝臟的損傷。更為嚴重者會引發肝功能衰竭，甚至危及生命[2-3]。研究者發現人體服用過量的APAP，經過細胞色素P450酶代謝，CYP450是人體重要的I相藥物代謝酶，種類繁多，可分為不同的家族，能代謝和轉化外源性和內源性化合物，減弱化合物的毒性或者使其毒性喪失。

已有研究報道，許多中藥能保護APAP造成的肝損傷[4-6]；而且中藥副作用小，臨床應用更廣泛[7]。黃連(Rhizoma coptidis)是毛茛科植物三角葉黃連或云連的干燥根莖，中國傳統中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功能[8]。其主要含有生物堿、小檗堿、黃連堿、黃連寧、巴馬汀等化學成分。現在藥理學研究表明，黃連具有降血糖、保肝、抗癌、免疫調節、改善心血管、降血壓等藥效[9-10]。黃連作為清熱解毒中藥，不僅藥理作用廣泛，還有較高的臨床應用價值。黃芩(Scutellaria baicalensis)為唇形科植物黃芩的根部，其在保肝、抗病毒、抗菌、抗氧化、消除自由基、抗過敏、保護神經元等多方面發揮作用[11]。臨床上黃芩素膠囊能有效治療急性肝炎。黃芩、黃連配伍使用在許多經典方劑中都有體現[12]，黃芩、黃連藥對始見于唐代王煮《外臺秘要》中的黃連解毒湯[10]，方中黃芩與黃連的配伍比例為1∶1，也出自于《傷寒論》，目前也已經成為臨床上常用的治療2型糖尿病、腸道菌群等疾病的藥對之一。CYP450酶是體內重要的代謝酶，尤其對毒性化合物在體內代謝發揮重要作用，但是黃連、黃芩有效化學成分對CYP450亞酶活性的影響尚不明確，所以本實驗基于計算機模擬技術研究黃連、黃芩化學成分與CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP2C9的相關性，預測可能結合的作用靶點，進一步從分子水平上探討黃連、黃芩保肝的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 配體庫的構建 基于TCMSP和TCM@taiwan網絡藥理學平臺篩選黃連-黃芩的化學成分，參照Lipinski 五規則的相關指標，符合 Lipinski 5個規則更有可能成為口服藥物，多數認為具有較好的ADME(absorption，distribution，metabolism，excretion)性質[13]。 黃連、黃芩化學成分篩選需要同時滿足：DL(類藥性)≥0.18，MW(分子量)≤500，2≤AlogP(脂水分配系數的對數值)≤5，OB(口服生物利用度)≥40%。OB受多種因素的影響，很多新藥在開發過程中沒有達到標準的OB，不能開發到臨床。一般認為 DL≥0.18 的分子具有較好的類藥性。通過Drug Bank篩選陽性藥[14]，谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)可以解救大劑量對乙酰氨基酚造成的藥物性肝損傷。谷胱甘肽在機體內是重要的自由基清除劑，同時也具有抗氧化能力。可以把機體內有毒的物質轉化為無毒物質，排出體內。N-乙酰半胱氨酸是巰基供體，能快速解救對乙酰氨基酚引起的肝損害。所有的化合物采用Open Babel-2.4.1 構建成三維結構，并對其加電荷、加氫，保存為mol2 格式。

1.1.2 CYP450亞酶晶體結構的準備 CYP450亞酶晶體結構從PDB庫(Protein Data Bank)中下載，CYP2E1、CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9的 PDB ID分別為3E6I、4NY4、2HI4、4WNU、4NZ2[14]。生物學效應見表1。

表1 靶標蛋白的基本信息

1.2 基于iGEMDOCK 進行虛擬篩選

iGEMDOCK是一個開源的分子對接軟件[18]，操作簡單，對接準確度較高，主要用于初篩和精度對接。小分子和大分子在進行構象匹配時，通用的標準對接方法為：子代(Generation)=70，Number of solution(解的個數)=2，generic evolutionary method中群體大小(population size)設為200。對黃連、黃芩化合物和CYP450亞酶的結合腔穴進行對接。讓小分子和大分子在幾何、能量匹配的原則上相互識別，尋找與CYP450亞酶匹配能量最低的小分子。在構象搜索過程中，該軟件考慮了氫鍵、范德華力和靜電作用進行經驗打分。

1.3 網絡模型的構建

基于Cytoscape構建黃連、黃芩和CYP450亞酶的網絡模型，現在用于網絡分析的工具主要有Cytoscape、數據可視化工具Gephi、Wireshark等，其中應用比較廣泛的為Cytoscape，其為一款開源的可視化軟件，操作簡單、快速，可以系統整合復雜的分子之間的相關性[19]。黃連、黃芩28個化學成分與5個CYP450亞酶進行網絡互作分析。網絡包含有效的化學成分和CYP450 2 類節點(node)。若CYP450為某化學成分的潛在作用靶點，則以邊(edge)相連。

2 結果

2.1 黃連、黃芩化學成分

參照Lipinski 五規則，黃連、黃芩符合條件的化合物一共有28個，其中黃連和黃芩有1個相同的化學成分，黃芩19個化學成分，黃連9個化學成分。具體信息詳見表2。

表2 黃連-黃芩化學成分

2.2 iGEMDOCK分子對接結果

iGEMDOCK結果以小分子和大分子匹配能量的多少決定結合的程度。如果匹配能量比較低，說明小分子和大分子結合的構象穩定。匹配能量比較高，說明結合的構象相對不穩定。將黃連、黃芩中28個化合物與CYP450酶的5個亞型進行能量匹配。結果顯示：28個化合物與CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、 CYP2C9有較好的結合，與CYP3A4結合的沒有陽性藥谷胱甘肽構象穩定。對接結果見圖1和表3。

圖1 黃連、黃芩化學成分與CYP2D6對接結果

2.3 黃連、黃芩化學成分與CYP450亞酶的網絡互作分析

黃連、黃芩28個化學成分，與CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4進行對接。陽性藥谷胱甘肽與CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4對接能量分別為-121、-130、-132、-126、-142 kcal·mol-1。而N-乙酰半胱氨酸整體匹配能量都較高，說明構象不穩定。所以黃連-黃芩主要與陽性藥谷胱甘肽進行比較。黃連、黃芩選擇CYP1A2≤-121 kcal·mol-1，CYP2E1≤-130 kcal·mol-1，CYP2D6≤-132 kcal·mol-1，CYP2C9≤-126 kcal·mol-1，CYP3A4≤-142 kcal·mol-1進行小分子和大分子關聯性分析。發現黃連、黃芩同時能與CYP1A2作用，黃連中的7個化學成分(Moupinamide，Palmatine，(R)-Canadine，Corchoroside A_qt，quercetin，Worenine，Epiberberine)與CYP1A2具有較低的結合能和較強的抑制作用，其中作用最強的是(R)-Canadine。黃芩中的4個化學成分(bis[(2S)-2- ethylhexyl]，5，7，4′-trihydroxy-8-methoxy flavanone，Epiberberine，NEOBAICALEIN)對CYP1A2有較強的抑制作用，其中作用最強的為NEOBAICALEIN。黃連、黃芩共有10個化學成分同時與CYP1A2結合，抑制其活性。其中Epiberberine為黃連、黃芩共有化學成分。同時黃連、黃芩共有3個成分同時與CYP2C9結合。黃芩中的3個化學成分與CYP2E1結合，2個化學成分與CYP2D6結合，而黃連與CYP2E1、CYP2D6的結合沒有陽性藥結合的穩定。黃連、黃芩通過與CYP450亞酶結合，黃連主要抑制CYP1A2和CYP2C9的活性，而黃連主要抑制CYP1A2、CYP2C9、 CYP2E1、 CYP2D6的活性。具體結果見圖2。

表3 黃連-黃芩與CYP450亞酶對接得分

3 討論

CYP2E1是一種I相毒物代謝酶，為代謝某些外源性和內源性化合物的重要酶系，是CYP450代謝酶家族中的重要一員。CYP1A2主要存在于人體的肝臟中，主要負責雜環胺類、芳香烴類和多數臨床藥物的代謝。CYP2E1和CYP1A2都具有破壞細胞結構、導致酶活性異常或失活、抑制基因表達甚至導致基因突變、加快細胞凋亡、導致機體疾病的發生或增加患病幾率。很多藥物的療效或毒性與CYP1A2和CYP2E1酶的活性有關，所以CYP1A2和CYP2E1一直受到毒理、藥理和藥物致癌等多個研究領域的關注[20]。APAP在治療劑量下，約5%～10%的APAP被CYP2E1、CYP3A4等代謝為具有肝毒性的N-乙酰對苯醌亞胺(NAPQI)，與還原型谷胱甘肽結合，消除其毒性。因此，在治療劑量下，APAP不會產生肝毒性。但是在大劑量服用時，特別是CYP2E1、CYP1A2等酶的誘導下，APAP產生的毒性代謝產物比較多，還原型谷胱甘肽無法全部消除，導致肝毒性。CYP2C9占CYP450蛋白總量的 15%～20%，在肝臟中表達，參與多種藥物的代謝。CYP3A4是CYP3家族A亞家族發現的第四種酶，主要負責機體內50%以上的臨床用藥[19]。CYP2D6參與多種重要藥物代謝，APAP在體內一部分也是通過CYP2D6進行代謝，但其高濃度時出現毒性作用[21]。因此可以通過抑制CYP450亞酶減弱APAP造成的肝損傷，減少毒性物質NAPQI的生成量。黃連、黃芩藥理作用都具有保肝作用，同時又是清熱解毒中藥，臨床應用廣泛，副作用少，無毒。黃連、黃芩10個化學成分(Moupinamide，Palmatine，(R)-Canadine，Corchoroside A_qt，quercetin，Worenine，bis[(2S)-2-ethylhexyl]，NEOBAICALEIN，5，7，4′-trihydroxy-8-methoxyflavanone，Epiberberine)共同抑制CYP1A2的活性。3個化學成分共同抑制CYP2C9的活性。而且黃芩對CYP2E1、CYP2D6的活性也有影響。進一步表明黃連、黃芩配伍使用可能保肝效果更好。同時也發現CYP450酶系可能是黃連、黃芩降低藥物性肝損傷的作用靶點，減少肝細胞損傷，從而達到保肝作用。

注：黃色表示黃連-黃芩共有化學成分；藍色表示化學成分；紅色表示CYP450亞酶。圖2 黃連-黃芩化學成分-CYP450亞型的網絡模型