小分子干擾RNA抑制黏著斑激酶基因對子宮內膜癌細胞生物學特征的影響

賈冬麗，方麗麗，司曉輝，王遠菊

子宮內膜癌約占女性生殖系統惡性腫瘤的三分之一，且發病率呈上升趨勢[1-2]，嚴重威脅女性健康。該病發生涉及多基因、多步驟、多信號通路。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)作為非受體蛋白酪氨酸激酶超家族成員，參與調控細胞增殖、生長、分化過程[3-4]，近年來研究發現[5]，FAK在多種惡性腫瘤組織中表達升高，且參與了腫瘤浸潤轉移、增殖、凋亡過程。本研究利用小分子干擾RNA(small interference RNA，siRNA)技術下調FAK基因表達，觀察對人子宮內膜癌細胞HEC-1A增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 資料與方法

本研究起止時間為2016年8月3日至2017年1月16日。

1.1主要試劑和設備人子宮內膜癌HEC-1A細胞購自中科院上海生命科學研究院，胎牛血清、DMEM/F12培養基、胰酶均購自美國Gibco公司，總RNA提取試劑盒(Trizol法)和Lipofectamine 2000轉染試劑盒由美國Invitrogen公司提供，逆轉錄和PCR試劑盒均購自武漢凌飛生物有限公司，FAK及內參引物均由上海生工生物公司設計合成，FAK干擾序列(siRNA-FAK)、陰性對照序列均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，MTT液購自上海將來實業股份公司，Transwell小室購自美國Corning公司，RIPA裂解液購自碧云天生物公司，磷酸酶抑制劑購自美國Sigma公司，兔抗FAK多克隆抗體購自武漢博士德公司，兔抗Akt單克隆抗體購自美國CST公司，兔抗磷酸肌醇3激酶(PI3K)單克隆抗體、兔抗磷酸化(p)-Akt多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，兔抗哺乳動物雷帕霉素(mTOR)靶蛋白、p-mTOR多克隆抗體購自美國Cell signaling公司，StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及處理 將細胞放于DMEM/F12培養基(含10%胎牛血清)中，培養于含5%CO2、37 ℃培養箱。細胞融合度>70%時，傳代培養。取對數生長期細胞，按試劑盒說明對細胞分組轉染：1siRNA-FAK組，轉染FAK特異性siRNA序列正義鏈為5’-CGCGTCGTAATACTCGCTCCATTGCACCTTGATATCCGGGTGCAATGGAGCGAGTATTATTTTTT-CCAAC-3’，反義鏈為5’-GCGGTGGACCCGGTCATAATAAAGTTCTGCTATTATGACCGGGTCCACC-AAAAAACAGCTGTTCGA-3’；2siRNA-陰性對照組，轉染siRNA-陰性對照序列正義鏈為5’-CGCGTCG-CCACTTACGATAGCTCCATTCTTGATATCCGGAAT-GGAGCTATCGTAAGTGGTTTTTTCCAAC-3’，反義鏈為5’-GATCCCCACCTGGGCCAGTATTATTTCAAGACGATAATACTGGCCCAGGTGGTTTTTTGTCGACA-3’；3空白對照組，不作任何處理。

1.2.2實時熒光定量PCR技術檢測細胞中FAK基因表達 各轉染后繼續培養48 h，按照用Trizol法提取試劑盒說明提取總RNA，檢測純度。逆轉錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板行PCR。引物序列：FAK上游為5’-TCCTAATGTTG ATGCCTGCC-3’，下游為5’-CCTTGAAAAGGCTTCACACC-3’；GAPDH上游為5’-TCCGGGTGATGCTTTTCCTAG-3’，下游為5’-TTTGCGGTGGAAATGTCCTTTTC-3’。反應條件：92 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s。循環38次，均設平行復孔3個。FAK基因相對表達量計算采用2-△△Ct法[6]。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖能力 將各組細胞離心后，重懸細胞，于96孔板接種(密度5×104個/孔)，繼續培養，于12 h、24 h、48 h、72 h、96 h時，向各孔加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h，終止培養，小心的將孔內上清液吸棄，將150 μL二甲基亞砜加入各孔，振蕩15 min，待結晶物完全溶解后，利用酶標儀檢測各孔在570 nm波長處的吸光度A值。重復實驗6次[7-8]。

1.2.4Transwell法檢測細胞遷移能力 各組細胞轉染后培養48 h，離心，留沉淀，用無血清培養基重懸，加入到Transwell小室上室(密度為1×105個/孔)，下室加入含有15%胎牛血清的培養基，恒溫培養24 h，取出小室，將散落的細胞去除，PBS沖洗3次，固定，結晶紫染色，用倒置顯微鏡觀察，隨機取5個視野對細胞計數，每組細胞設置3個平行復孔，重復實驗6次[9]。

1.2.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 將 Martrigel基質膠稀釋后鋪于小室上室，過夜風干。其余步驟同1.2.4。

1.2.6蛋白質印跡法(Western blot)檢測細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達 各組細胞轉染后培養48 h，用預冷的RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑分別提取總蛋白并檢測純度。取總蛋白30 μL，進行10%聚丙烯胺凝膠電泳，電至PVDF膜上，用3%牛血清白蛋白室溫下封閉60 min，TBST沖洗3次，加入一抗FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR(稀釋比例1∶1 000、1∶800、1∶1 200、1∶500)，4 ℃過夜孵育，TBST沖洗3次，將二抗加入，37 ℃孵育60 min，用TBST沖洗3次，暗室下用ECL反應15 min，用Image J軟件分析，計算細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量[10]。

表1 各組細胞增殖能力(A值)比較/±s

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-陰性對照組比較，bP<0.05

2 結果

2.1FAK基因在各組細胞中表達FAK mRNA在siRNA-FAK組細胞中相對表達量為(1.31±0.15)，顯著低于siRNA-陰性對照組和空白對照組，分別為(2.06±0.18)和(2.11±0.20)，差異有統計學意義(F=53.294，P<0.001)。

2.2細胞增殖能力siRNA-FAK組、siRNA-陰性對照組和空白對照組12 h時細胞吸光度A值差異無統計學意義(P=0.626)。siRNA-FAK組、siRNA-陰性對照組和空白對照組24 h、48 h、72 h和96 h時細胞吸光度A值均差異有統計學意義(P<0.005)；與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組24 h、48 h、72 h、96 h時細胞吸光度A值均降低，均差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1和圖1。

圖1 各組細胞增殖能力比較

組別平行復孔數遷移細胞數侵襲細胞數空白對照組3123.6±15.4140.2±14.3siRNA-陰性對照組3119.5±14.8137.8±13.5siRNA-FAK組379.6±11.7ab91.5±10.6abF值20.31219.517P值<0.001<0.001

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-陰性對照組比較，bP<0.05

2.3細胞遷移和侵襲能力siRNA-FAK組、siRNA-陰性對照組和空白對照組遷移細胞數和侵襲細胞數均差異有統計學意義(P<0.001)；與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組遷移細胞數和侵襲細胞數均減少，均差異有統計學意義(P<0.005)，詳見表2、圖2、圖3。

2.4細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達siRNA-FAK組、siRNA-陰性對照組和空白對照組FAK、PI3K、AKT、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量均差異有統計學意義(P<0.001)；siRNA-陰性對照組與空白對照組FAK、PI3K、AKT、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量均差異無統計學意義(P=0.694、0.262、0.623、0.541、0.645、0.731)；與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達相對表達量均降低(P<0.005)，而Akt和mTOR蛋白相對表達量均升高(P<0.005)，詳見表3和圖4。

表3 各組細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達比較/±s

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-陰性對照組比較，bP<0.05

圖4 各組細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達

3 討論

子宮內膜癌好發于絕經后女性，但近年來出現年輕化趨勢[11]，雖然現在子宮內膜癌病人生存時間得到延長，但其高復發率、高病死率仍嚴重威脅病人預后[12-13]。研究表明[14]，腫瘤發生、進展、轉移、侵襲涉及諸多基因、步驟和通路。FAK作為一種廣泛存在于細胞質內的非受體蛋白酪氨酸激酶，是整合素信號家族中重要的信號因子[15]，與多種細胞生物學過程中發揮重要作用[16]。研究表明[17]，FAK高表達于多種惡性腫瘤組織中，參與了腫瘤發生、進展、侵襲過程。Zhou等[18]指出，FAK在子宮內膜癌組織中呈高表達，且與病人總生存期降低顯著相關。本研究結果顯示，siRNA-FAK組細胞中FAK mRNA和蛋白相對表達量均降低，提示利用siRNA技術可成功將HEC-1A細胞中FAK基因表達抑制。

MTT實驗結果顯示，與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組24 h、48 h、72 h、96 h時細胞吸光度A值降低，說明沉默FAK基因細胞增殖活力被抑制，提示該基因與細胞增殖過程密切相關。本研究顯示，與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組遷移細胞數和侵襲細胞數減少，說明在沉默FAK基因表達后細胞遷移和侵襲能力被抑制，提示該基因可能與細胞遷移和侵襲過程關系密切[19]。PI3K/Akt/mTOR作為與腫瘤增殖、侵襲轉染密切相關的信號通路，在多種惡性腫瘤組織中表達異常[20]，有研究指出[21]，PI3K/Akt/mTOR信號通路異常活化可抑制腫瘤細胞凋亡，促進細胞增殖，加快細胞侵襲、轉移過程。本研究顯示，在抑制FAK基因表達后，siRNA-FAK組細胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達相對表達量均降低，說明特異性抑制HEC-1A細胞中FAK基因可顯著抑制PI3K/Akt/mTOR信號活化，提示FAK基因可能通過PI3K/Akt/mTOR信號而參與子宮內膜癌細胞增殖、遷移及侵襲過程。

綜上所述，沉默FAK基因可減少HEC-1A細胞增殖，抑制細胞遷移及侵襲，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號有關，有望為子宮內膜癌基因治療提供潛在的靶位。

(本文圖2，3見插圖1-2)