甲狀腺乳頭狀癌組織中G-蛋白偶聯受體5和組織蛋白酶D的表達及臨床意義

李文翠，高波，張吉才

甲狀腺乳頭狀癌是常見的甲狀腺惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的3/5～4/5[1]。與其他惡性腫瘤相比，大部分甲狀腺乳頭狀癌的病人的手術治療效果和遠期預后較好，但仍然有部分病人存在腫瘤局部侵襲和淋巴結轉移，這部分病人的治療效果及預后都較差[2]，因此尋找甲狀腺乳頭狀癌的高危復發和轉移的因素與檢驗標志物尤為重要，有研究[3-4]提示G-蛋白偶聯受體5(LGR-5)和組織蛋白酶D(Cath D)在肝臟、胃腸道、呼吸等系統的惡性腫瘤中均有過表達，并且與疾病的發展和浸潤轉移相關，但對二者在甲狀腺腫瘤中的表達研究較少。筆者檢測了LGR5和Cath D在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁組織中表達情況，探討它們的表達與腫瘤浸潤和轉移的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料納入2014年1月至2017年3月湖北省十堰市太和醫院首診甲狀腺癌病人，通過手術切除癌組織病理活檢提示為原發性甲狀腺乳頭狀癌病人67例，其中男性15例，女性52例；大于45歲38例，小于或等于45歲29例；腫瘤直徑大于2 cm 34例，小于或等于2 cm 33例；腫瘤有局部侵犯包膜32例，有頸部淋巴結轉移37例。所有病人均依據2016年美國甲狀腺學會制定的甲狀腺癌的TNM標準[1]進行臨床和病理分期，Ⅲ+Ⅳ期29例，Ⅰ+Ⅱ期38例。對照組選取相同腫瘤病人距離癌邊緣大于2 cm的正常甲狀腺組織，光學顯微鏡下確診無癌細胞。所有病人都簽署了知情同意書，本研究通過了湖北省十堰市太和醫院醫學倫理委員會批準(G20130278)。

1.2方法

1.2.1試驗方法 選擇LGR5試劑盒(武漢博士德)，Cath D試劑盒(武漢博士德)，采用免疫組化法檢測兩組病人甲狀腺組織中LGR5、Cath D的表達。一抗兔抗人Cath D多克隆抗體、兔抗人LGR5多克隆抗體稀釋成1∶400，放置于4 ℃的冰箱中備用。通過切片-脫蠟-水化-浸泡-阻斷過氧化物酶-一抗-二抗-顯色-復染-脫水-封片等步驟，最后在切片上滴加適量中性樹脂膠，封片，晾干。

1.2.2結果判定標準 LGR5陽性表達位于細胞核或細胞質內，Cath D陽性表達位于細胞質內，呈均勻一致的棕色顆粒。在切片中選取5個高倍視野(400倍)，計數 200個細胞，統計陽性細胞占全部腫瘤細胞的百分比，陽性細胞百分比<10%為陰性，≥10%為陽性。

1.3統計學方法通過SPSS 16.6軟件進行統計分析。計數資料用例數及率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1甲狀腺乳頭狀癌和癌旁正常甲狀腺組織中LGR5及CathD的表達甲狀腺乳頭狀癌和癌旁正常甲狀腺組織中LGR5的陽性表達率分別為62.69%(42/67)、2.99%(2/67)，差異有統計學意義(P<0.05)。Cath D的陽性表達率分別為70.15%(47/67)、4.48%(3/67)，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。LGR5、Cath D在甲狀腺乳頭狀癌和癌旁甲狀腺組織中的免疫組化染色結果見圖1，2。

2.2甲狀腺乳頭狀癌組織中LGR5和CathD表達與不同臨床病理因素的關系在甲狀腺乳頭狀癌組織中，LGR5和Cath D在較大的腫瘤直徑，腫瘤局部外侵，頸淋巴結轉移，以及較晚的TNM分期中表達的陽性率較高，差異有統計學意義(P<0.05)；其中部分表達與病人年齡與性別無關(P>0.05)，見表2。

表1 LGR5及Cath D在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁組織的表達/例(%)

表2 甲狀腺乳頭狀癌中LGR5和Cath D在不同臨床病理因素中的表達

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌總體預后良好，但仍有10%～30%的病人出現早期復發和轉移。甲狀腺乳頭狀癌預后不良的主要臨床病理因素主要包括腫瘤組織的局部侵襲和頸部淋巴結轉移[5-6]。LGR5 作為Wnt信號通路的靶基因和腫瘤干細胞標志物，屬于跨膜蛋白激酶受體，有研究表面LGR5陽性的細胞具有分化成為所有的上皮細胞的潛能，其參入腫瘤細胞由幼稚到成熟的過程，對腫瘤內在起到調控的作用，與多種腫瘤的生物學進展密切相關，還是特異性較高的腫瘤標志物[7]；Cath D是一種蛋白水解酶，其能分解基膜和間質I、Ⅲ型膠原蛋白、肌動蛋白及纖維連接蛋白等，促進腫瘤細胞的浸潤，其活化后可以溶解并催化基底膜和細胞外基質，使局部形成溶解的區域，此時細胞間通路打開，對腫瘤的惡變和轉移有明顯促進作用，參入腫瘤的淋巴道轉移，對細胞代謝產物加工、細胞內蛋白質代謝、細胞凋亡過程起到重要作用[8]。

本研究發現，甲狀腺乳頭狀癌組織中LGR5和Cath D陽性表達率明顯高于癌旁正常甲狀腺組織，其機制可能與Wnt/β-catenin信號通路失調有關，該信號通路可促進腫瘤干細胞的增殖、甲狀腺結構破壞、加速腫瘤分化、加快頸部淋巴結轉移和血管浸潤[9-10]。這與我國盧秀波等[11]的研究結果一致，其運用逆轉錄聚合酶鏈反應及免疫組化SP法檢測40例甲狀腺癌病人組織蛋白酶B(Cath-B)的陽性表達率高達82.5%。國外專家早有研究[12]顯示甲狀腺癌惡性腫瘤的平均Cath D活性與甲狀腺冷良性結節(P<0.001)和Graves病組織(P<0.05)差異有統計學意義，進一步論證了甲狀腺癌中Cath D的過表達增加了cath D在腫瘤生長和轉移中的潛在作用。國內還有研究[13]表明Cath D在乳腺癌組織陽性表達率明顯高于正常乳腺組織，Cath D的表達與乳腺癌臨床分期、淋巴結轉移、腫瘤體積、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達密切相關，進一步證實了Cath D與腫瘤的發生、發展的作用。

本研究還發現，有淋巴結轉移者LGR5和Cath D陽性表達率(94.59%與89.19%)明顯高于無淋巴結轉移者(46.67%與50.00%)，有局部包膜侵犯的腫瘤組織中LGR5和Cath D陽性表達率(87.50%與90.62%)明顯高于無局部包膜侵犯的組織，可能是LGR5及Cath D通過旁分泌機制，促進間質成纖維細胞外向性生長、刺激腫瘤新生血管的形成[14]、加速腫瘤細胞的局部浸潤與遠處轉移。研究還發現腫瘤直徑越大，TNM分期越高，LGR5及Cath D的陽性表達率越高，與腫瘤的惡性程度和復發轉移風險呈正相關。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌組織中LGR5和Cath D的高表達與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，通過檢測它們的表達，對甲狀腺乳頭狀癌的生物學行為可能具有一定的臨床意義。

(本文圖1，2見插圖1-1)