化生平合劑對幽門結扎型大鼠胃黏膜損傷的保護作用

趙文娜，惠 先，董旺青，謝人明，張愛軍，王清暉*

(1.西安交通大學第二附屬醫院，西安 710004；2.西北大學陜西省生物醫藥重點實驗室，西安 710069)

化生平合劑由黃芪、丹參、虎杖、桃仁、莪術、雞內金、白花蛇舌草、三七和白芨等十二味中藥制成，具有補氣活血、清熱解毒的功效，對慢性淺表胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃腸腺化生及不典型增生等癥療效確切。對其藥理及臨床療效的研究已有相關報道[1-2]，為了進一步探索其藥理作用機制，本文采用幽門結扎法[3-4]建立大鼠急性胃損傷模型，探討化生平合劑對其胃液量、胃酸排出量、胃泌素(GAS)和白介素-8(IL-8)的影響及胃黏膜損傷修復的作用，為臨床研究提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 小動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；TGL 16G型離心機(上海安亭科學儀器廠)；Leitz 1512型旋轉式切片機(德國LEITZ 公司)；Sartorius BT 25S型精密分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；DW-26L262型低溫保存箱 (青島海爾股份有限公司)；Olympus DP-71型顯微鏡 (日本Olympus公司)。

1.2試藥 化生平合劑 (西安交通大學第二附屬醫院，批號170418)；西咪替丁片(山西同達藥業有限公司，批號160904)；吸入用七氟烷(上海恒瑞醫藥有限公司，批號17071731)；生理鹽水 (四川科倫藥業股份有限公司)；甲醛 (分析純，天津市天力化學試劑有限公司)；大鼠胃泌素(GAS)和白介素-8(IL-8)放免試劑盒 (北京華英生物技術有限公司)。

1.3動物 雄性SD大鼠，體質量180～220 g，購自西安交通大學實驗動物中心。動物許可證號：SCXK(陜)2012-003。

2 方法

2.1動物分組及給藥 50只雄性SD大鼠適用性喂養1周后隨機分成5組，化生平合劑高、中、低劑量組分別按照14.6，7.3 和3.6 g·kg-1·d-1灌胃化生平合劑，陽性對照組按照0.2 g·kg-1·d-1灌胃西咪替丁水溶液，模型組每日給予等體積生理鹽水，連續給藥7 d。

2.2動物造模 采用大鼠幽門結扎法進行造模。大鼠常規飼養并灌胃到第8 d時，各組動物禁食不禁水24 h。于第9 d灌胃1 h后開始實驗，先將大鼠用七氟烷麻醉后固定在鼠板上，剔除腹部皮毛，用止血鉗撐開大鼠腹腔，使胃部暴露，找到胃和十二指腸交界處，在胃幽門下穿一線(勿傷及周圍血管)，將幽門結扎，同時經十二指腸給予被試藥物，對照組給予等體積生理鹽水。縫合腹壁切口，用生理鹽水沖洗后將大鼠放回飼養籠內。

2.3觀察指標及檢測

2.3.1血清樣本的檢測 禁水禁食5 h后用烏拉坦麻醉大鼠，頸動脈取血。將收集的大鼠血液以3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，在-20 ℃冰箱中保存。用放射免疫法測定GAS及IL-8的含量。

2.3.2胃液量及胃液總酸度的測定 打開大鼠腹腔，結扎其賁門，摘取全胃，用生理鹽水沖洗干凈后沿胃大彎剪開大鼠胃部，傾倒其胃內容物于潤濕的漏斗中，過濾于有刻度的試管中，記錄收集的胃液量。取濾過的胃液1 mL，加入質量濃度為10 g·L-1的酚酞試液2滴，用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉對照品溶液進行滴定，滴定終點為紅色且在2 s內不消失，記錄消耗的氫氧化鈉對照品溶液的量，計算胃液總酸度。

2.3.3胃組織肉眼形態觀察 摘取全胃，用生理鹽水沖洗，肉眼觀察并記錄各組特征，沿胃大彎剪開大鼠胃部，將剪開的胃組織用生理鹽水沖洗干凈，將胃組織盡量展平后觀察胃黏膜的色澤、腫脹度及潰瘍形成等情況。

2.3.4胃組織病理組織學觀察 將2.3.3項下剪開的胃組織觀察記錄后，用濾紙吸干，立即放入體積分數為10%的中性甲醛固定液中。經包埋、切片、HE染色處理后，在光鏡下觀察大鼠胃部組織病理變化。

3 結果

3.1化生平合劑對大鼠GAS及IL-8活性的影響 見表1。由表1可知，與模型組比較，化生平合劑高、中、低劑量組GAS含量均有所降低，陽性對照組也降低，且化生平合劑高、中劑量組及陽性對照組差異有統計學意義(P<0.05)，化生平合劑低劑量組則差異不顯著(P>0.05)；化生平合劑各劑量組及陽性對照組IL-8的含量均有所降低，但與模型組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1化生平合劑對大鼠GAS及IL-8活性的影響

分組nGAS/pg·mL-1IL-8/pg·mL-1模型組10118.77±11.3179.65±21.75化生平合劑低劑量組9101.44±17.7174.94±17.38化生平合劑中劑量組10100.79±11.67?72.76±12.67化生平合劑高劑量組9 96.87±14.41?60.63±19.25陽性對照組10 91.32±22.80?70.89±27.62

注：與模型組比較*P<0.05。

3.2化生平合劑對大鼠胃液量的影響 見表2。由表2可知，各給藥組均可使大鼠胃液含量降低。與模型組相比，化生平合劑給藥后高、中劑量組及陽性對照組均可使大鼠胃液量顯著減少(P<0.01)，化生平合劑低劑量組也可降低大鼠胃液量(P<0.05)。

表2化生平合劑對大鼠胃液量的影響

分組給藥劑量/g·kg-1·d-1n胃液量/mL模型組4.0 mL105.41±1.44化生平合劑低劑量組3.693.89±1.62?化生平合劑中劑量組7.3103.04±1.61??化生平合劑高劑量組14.692.32±1.94??陽性對照組0.2103.22±1.57??

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.3化生平合劑對大鼠胃液酸度的影響 見表3。胃液酸度是胃潰瘍形成的關鍵因素，結果顯示，化生平合劑高、中、低劑量組及陽性對照組均在一定程度可使大鼠胃液酸度降低，但與模型組對比，只有化生平合劑高劑量組和陽性對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，化生平合劑中、低劑量組與模型組相比差異無統計學意義。

由表2和表3可知，化生平合劑可通過減少胃液含量、降低胃液中的胃酸活力，從而達到對胃黏膜的保護與修復，起到治療胃潰瘍的作用。

表3化生平合劑對大鼠胃液酸度的影響

分組給藥劑量/g·kg-1·d-1n胃液酸度/mmol·L-1模型組4.0 mL100.082±0.092化生平合劑低劑量組3.690.081±0.096化生平合劑中劑量組7.3100.078±0.097化生平合劑高劑量組14.690.065±0.084??陽性對照組0.2100.049±0.098??

注：與模型組比較**P<0.01。

3.4化生平合劑對大鼠胃組織病理形態的影響 見圖1。處死大鼠，摘取全胃，肉眼可見模型組胃體顯著增大，胃中充滿胃液，胃黏膜有充血、水腫、潰瘍及出血點，光鏡下胃黏膜表面上皮局部出血、壞死，固有層有較多的中性粒細胞浸潤。化生平合劑高、中、低劑量組及陽性對照組與模型組相比，胃體較小，胃液較少，胃黏膜水腫、充血較模型組輕，有個別散在的出血點，光鏡下顯示胃黏膜上皮少見缺失，固有層中性粒細胞少許浸潤，各給藥組之間病理形態差異不顯著。說明化生平合劑高、中、低劑量組對幽門結扎法所致的大鼠急性胃黏膜損傷均有一定的保護修復作用。

圖1大鼠胃組織病理學觀察(H&E，200×)

A.模型組；B.陽性對照組；C.化生平合劑低劑量組；D.化生平合劑中劑量組；E.化生平合劑高劑量組。

Fig.1 Pathological observation of gastric tissue in rats (H&E，200×)

A.model group；B.positive control group；C.Huashengping Mixture low dose group；D.Huashengping Mixture middle dose group；E.Huashengping Mixture high dose group.

4 討論

中醫講究“治未病”原則，根據胃病早期的臨床癥狀將其歸為胃脘痛、痞滿等范疇，治療以補益脾胃、活血化瘀、清熱解毒為原則。運用化生平合劑進行治療，方中君藥黃芪與白芨可補氣生血、去腐生肌；臣藥白花蛇舌草、虎杖和黃連有清熱利濕解毒之功；丹參、桃仁和三七活血化瘀，三者共為佐藥，使瘀血去而新血生，瘡瘍去而新肉生；使藥雞內金發揮消食健脾的功效，甘草既能益氣補中、清熱解毒、和中緩急止痛，又能調和諸藥。研究證實，丹參能通過抑制胃酸及胃蛋白酶分泌，改善胃黏膜供血及胃潰瘍患者的氧化應激狀態等機制促進潰瘍創面的愈合[5-7]。黃芪和三七能通過促進HSP70的表達而保護受損的胃黏膜細胞并進行修復[8-9]。黃連通過對幽門螺桿菌的抑制作用等機制提高胃黏膜屏障功能[10-12]。此外，白芨、甘草和虎杖等單味中藥在治療胃潰瘍方面均有研究報道[13-18]。蔡永敏等[19]通過采用信息定量統計方法，對治療胃潰瘍的中藥進行檢索和排名，發現丹參、黃連、黃芪、甘草和黃芪等幾味中藥在治療胃潰瘍等相關疾病中使用頻次最高。諸藥合用，使氣虛者補氣，血瘀者行血，肉腐者生新，元氣內充，血液得運，死肉可除，則諸證自愈。

早在20世紀70年代，相關研究表明，胃癌的發生是經過正常胃黏膜→慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→胃黏膜腸上皮化生→胃黏膜異型增生→胃癌這一多步驟、逐漸進展的過程，在演變過程中伴隨著眾多分子的改變及基因的累積[20-21]。一般認為，胃黏膜的損傷是由胃酸、胃蛋白酶、幽門螺桿菌、GAS和炎癥因子等攻擊因子與前列腺素E2(PGE2)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)和生長抑素(SS)等保護防御因子的失衡有關[22]。GAS由胃竇G細胞分泌，可通過直接作用于胃壁細胞上的GAS受體，促進胃酸的分泌，GAS含量増加可導致胃酸的増加，加重胃黏膜損傷[23]。急性胃黏膜損傷后GAS增高可能是由于PGE2的合成降低導致對GAS的分泌、釋放控制減弱，GAS具有促進胃酸分泌的作用[24]，胃酸過多分泌會進一步刺激損傷部位，加劇胃黏膜損傷。而藥物治療可使升高的GAS水平下降至正常水平，使胃黏膜有損傷作用的胃酸和胃蛋白酶原的過度分泌得以控制，從而減輕胃黏膜的損傷[25]。胃黏膜受損后會激活體內免疫系統所引起的各種炎癥細胞的活化，產生IL-1、IL-8 及TNF-α等促炎細胞因子，引起或加重炎癥反應[26]。IL-8是由單核細胞、巨噬細胞等多種細胞產生的，主要是趨化和激活嗜中性粒細胞在炎癥部位聚集，加劇炎癥的發生[27]。當發生局部炎癥或敗血癥時，外周血中的IL-8水平檢測值可升高。

總之，化生平合劑可通過抑制胃酸液及GAS分泌，降低胃液排出量及炎癥因子IL-8水平，達到保護胃黏膜、治療和修復胃黏膜損傷的作用，可為化生平合劑在臨床上治療胃黏膜損傷提供理論依據。