茶園土壤中優勢菌株棘孢曲霉的分離與鑒定

宋加艷 ，周小露 ，劉麗明 ，趙幸運 ，石 悅 ，周才碧

（1.黔南民族師范學院生物科學與農學院，貴州都勻558000；2.湖南農業大學園藝園林學院，湖南長沙410000）

貴州省茶葉種植面積約46.7萬hm2，是全國種植茶葉面積最大的省份，其中，黔南州的種植面積為10.7萬hm2，也是貴州省比較重要的茶區之一。黔南州在《關于進一步加快推進茶產業發展的意見》中明確提出有機茶今后的發展目標，以及在有機茶園建設中，必須提高無害化有機肥的投入使用。有機肥是特定的微生物與經過腐熟等工藝流程的農作物秸稈復合而形成的微生物有機肥料，其具有無毒性、肥效高、成本低、節約能源等優點。

茶樹生長必需的養分大部分是土壤供給的，但土壤中的營養物質只能通過施肥來補充。長期大量施用化肥，容易導致土壤板結、酸化、地下水硝酸鹽含量超標以及土壤基礎肥力下降等問題。施用化肥也是茶葉有害物質超標的主要原因之一，特別是含鉛、汞等化肥引起的重金屬超標。

相關研究表明，貴州茶區存在不同程度的土壤酸化、重金屬超標、農藥殘留等問題。如都勻茶區pH值3.50～4.00，土壤嚴重酸化[1-2]；湄潭和鳳岡茶區pH值在4.00～4.50，土壤酸化；正安茶區pH值在4.00～5.00，土壤有酸化趨勢；云霧區存在嚴重的Cd和Hg污染[3]；貴定縣有2個茶園土壤處于輕污染狀態，8個鄉鎮處于警戒限范圍[3-5]；貴州省約9個市茶區鉛[6]、氯氰菊酯等重金屬均有不同程度的檢出，但沒有超標。

施用化肥是一種給茶樹補充營養物質的有效途徑，能為茶樹的生長發育提供充足的營養成分，又可在一定程度上改良土壤。土壤是植物吸收養分的主要來源之一，通過給茶樹施肥能改良茶樹因缺少大量元素帶來的葉片發黃等問題。茶樹專用有機肥，速效與緩效養分協調、肥料利用率比較高，可以減輕氮肥造成的硝酸鹽積累以及磷鉀肥造成的污染，其既可作基肥又可作追肥，將成為農業生產的必然選擇。因此，都勻毛尖茶區專用有機肥菌種資源的開發與應用具有極其重要的意義。

本試驗以黔南州茶園優質土壤為材料，分離、純化得到優勢菌株，并對其進行形態鑒定和分子鑒定，旨在明確優勢菌株的種屬關系，為其在茶園專用有機肥的開發提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 供試土樣采集于貴州省黔南州都勻市三江堰茶園。

1.1.2 試劑與儀器 蔗糖（化學純，貴陽中川化工有限公司），磷酸二氫鉀（分析純，壽光市艾益農生物科技有限公司），七水合硫酸鎂（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司），氯化鉀（分析純，天津市福晨化學試劑廠），瓊脂粉（北京鼎國昌盛生物技術責任有限公司），七水合硫酸亞鐵（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司），硝酸鈉（分析純，貴陽中川化工有限公司）等。

電子顯微鏡（XSP-8C，德卡精密量儀有限公司），電子天平（LTI000B，常熟市天量儀器有限責任公司），恒溫培養箱（BIC-250，上海博迅實業有限公司），超凈工作臺（SW-CJ1FDA，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋（GI54DS，致微儀器有限公司），冰箱（BCD-251WBSV，上海帝覽實業有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制 參考周才碧等[7]的方法，按試驗要求進行適當修改。PDA培養基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉20 g。WA培養基：瓊脂粉13 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 菌株分離培養 稱取20 g茶園土樣放入三角瓶，加入80 mL無菌水，搖勻制備成菌種懸液，并將其稀釋成不同濃度菌種溶液備用。再用接種環蘸取不同稀釋濃度的菌種懸浮液1～2滴，采用涂布法接種于PDA培養基上，每個稀釋濃度6個重復；將PDA培養基放入28℃恒溫培養箱中，培養6～7 d，有菌落形成時，即對菌株進行純化處理。

1.2.3 菌株純化培養 待培養基上的菌落培養6 d可以明顯觀察到菌落時，挑選生長旺盛的菌落，用平板劃線法接種到PDA培養基上；并將培養基放入培養箱繼續培養，待菌落長出較多時，繼續劃線純化，直到純化出單一菌落。

1.2.4 菌株形態特征觀察 利用電子顯微鏡對菌種菌落的孢子囊、分生孢子、厚垣孢子及生長速率等形態特征進行觀察記錄，以對該菌種菌落的類型進行初步判斷。

1.2.5 菌株生長速率測定 在無菌環境下，把優勢菌株打成直徑為5 mm的菌餅，再轉移至25℃培養箱中，培養7 d，量取菌落直徑并再次記錄其特征。

1.2.6 菌株分子生物學鑒定

1.2.6.1 DNA的提取 挑取約1 mg優勢種菌絲，研磨，依次加入500μL裂解液、150μLKAC和50μL異丙醇，反復離心15 min；收取上清液，加等體積70%的乙醇，離心10 min；等待水分散失，加0.1×TE 30 μL，收集上清液得優勢種菌絲DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，紫外分光光度法檢測DNA的濃度，再稀釋至30～50 ng/μL，備用。

1.2.6.2 PCR擴增 用于引物篩選的PCR擴增反應的總體積為 25 μL：1 μL DNA 模板，10×Buffer的緩沖液體 2.5 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物各1 μL，ExTaq DNA聚合酶 0.1 μL和 ddH2O 17.4 μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50～60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循環32次；最后72℃延伸5 min；12℃保存備用。以通用引物 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，蘇州金唯智生物技術有限公司合成）為引陰性對照，進行PCR擴增，4℃冰箱保存PCR擴增產物。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，將PCR擴增產物送到測序公司測序。

1.3 數據統計

所得序列提交到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸數據庫，通過 BLAST 程序，將28SrDNA序列與GeneBank中的核酸序列進行對照，并從數據庫中獲得相關序列。采用MEGA 6.0軟件進行多序列比對，并利用Neighbor-Joining方法構建進化樹，確定菌株類別。

2 結果與分析

2.1 目標菌株的分離、純化

以優質土壤為材料，利用稀釋涂布分離得到5種菌；進一步利用平板劃線純化該菌株，最終得到優勢菌株S1（圖1-A），該菌株在25℃的PDA培養基中生長旺盛，生長周期較長。

2.2 目標菌株的鑒定

2.2.1 形態鑒定 利用傳統形態學鑒定的方法，對分離、純化得到的菌株進行觀察。

通過肉眼觀察，菌絲體為白色，在培養基表面葡匐向上生長，是氣生菌絲中的繁殖菌絲。利用電子顯微鏡觀察，優勢菌種形態特征鮮明，容易識別，其菌落較大，菌絲體向上生長出孢子體，孢子體為圓形，褐色。根據菌株的菌落和孢子形態等特征，初步推斷該菌屬為棘孢曲霉（圖1）。

2.2.2 分子鑒定 以棘孢曲霉菌株DNA為模板，用通用引物ITS1/ITS4擴增得到1條646 bp的清晰條帶（圖 2）。

將PCR產物測序后提交到GenBank中，經BLAST比對后發現，病原真菌的rDNA-ITS序列與Phytophthora nicotianae（MG496018.1）的序列相似度高達99%。依據比對結果構建系統進化樹（圖3），表明該菌應歸為Aspergillus aculeayus。結合形態學與分子生物學鑒定，確定其為曲霉屬中的棘孢曲霉。

棘孢曲霉（Aspergillus aculeayus）的具體分類地位如下：

3 結論與討論

土壤是微生物的大本營，天然棲息地[8]。土壤微生物是陸地生態系統植物多樣性和生產力的重要驅動者，直接參與了植物獲得養分和土壤養分循環2個過程[9]。本試驗以黔南州茶園優質土壤為材料，進行稀釋，并將樣品懸液涂布于培養皿培養得出多種菌種，又對菌種進行分離，再挑取菌種純化得到優勢菌株。為了明確優勢菌株的種屬關系，首先對于優勢菌株的鑒定主要采用傳統的生物形態學鑒定法，利用電子顯微鏡進行觀察[10]，初步確定該優勢菌株為曲霉屬；其次，對于優勢菌株采用ITS序列（分子）鑒定法，確定其為棘孢曲霉。

棘孢曲霉JMUdb058固態發酵產酶的能力突出，是一種高產柚苷酶[11]、β-葡萄糖苷酶[12]的微生物新資源。從土壤真菌棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）中分離得到2個新化合物和2個已知化合物，活性測試結果表明，4個化合物均表現出一定的抗氧化活性[13]。