馬鈴薯不同起始外植體不定根快速誘導體系的建立

張紫娟 ，侯雷平 ，薛紅衛(wèi) ，許智宏 ，4，朱木蘭 2，

（1.山西農業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801；2.中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海辰山植物園，上海201602；3.中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所，上海200032；4.北京大學現代農學院，北京100080）

油菜素內酯（Brassinolide，BL）又名蕓苔素內酯，是一種新型植物內源激素，在國際上已被列為第六大類植物激素[1]。20世紀70年代初，美國科學家MITCHELL等[2]首次從油菜花粉中分離出了對植物生長具有調節(jié)功能的生理活性物質，將其命名為油菜素（Brassins）。1979年，GROVE 等[3]分離出油菜素，并鑒定了其分子立體結構，確認該物質為一種甾醇類化合物，并正式將其命名為油菜素內酯。目前，在植物界已發(fā)現了60多種油菜素內酯類化合物，統(tǒng)稱為油菜素內酯化合物（Brassinosteroids，BRs）[4]。

作為一種類固醇類激素，油菜素內酯在植物生長發(fā)育過程中起著不可忽視的作用，它能促進細胞伸長，影響細胞的分裂分化，促進植物進入生殖生長，影響花誘導及分化，同時還能提高植物對逆境條件的抵御能力[5]。而2，4-表油菜素內酯（2，4-epibrassinolide,EBR）是其中用途較廣泛、使用較多的一種[6]，且近年來對它的研究越來越多，如在種子萌發(fā)、幼苗生長等方面，而在農作物離體再生方面的應用效果鮮見報道。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬雙子葉植物綱茄科茄屬，1年生草本植物，是一種糧菜兼用作物，具有產量高、適應性強、分布范圍廣等特點；又是很多加工產品的原材料，用途廣泛，產業(yè)鏈長，在農業(yè)生產以及人民生活中具有不可替代的作用[7]。自2016年馬鈴薯被作為主糧產品進行產業(yè)化開發(fā)后，其栽培面積更加廣泛，產業(yè)規(guī)模大幅提高，馬鈴薯種苗市場的需求量顯著增加[8]。因此，急需馬鈴薯高產優(yōu)質的種苗生產方法。

離體再生技術為馬鈴薯的種質資源創(chuàng)新、種苗脫毒快速繁殖、工廠化育苗提供了有效途徑。因此，在馬鈴薯物種上應用離體再生技術時，縮短馬鈴薯離體再生過程中的滯瓶期，加快工廠化出苗進程尤為重要。

本研究以馬鈴薯品種大西洋無菌試管苗為試材，以2，4-表油菜素內酯為主導植物生長調節(jié)劑，對馬鈴薯不同起始外植體不定根快速誘導的最佳體系進行了篩選，以期為日后馬鈴薯離體再生的相關研究以及工廠化育苗提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為上海辰山植物科學研究中心遺傳轉化平臺儲備提供的馬鈴薯品種大西洋的無菌苗。

1.2 基本培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂粉，pH值調至5.80；所有培養(yǎng)基均經121℃滅菌17 min，植物激素經過濾滅菌后添加到受試培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為光照強度1 500～2 500 lx，光照時長 16 h/d，溫度（23±1）℃。

1.3 試驗方法

選取長勢良好的幼苗（2.0～3.0 cm）、莖段（1.0～1.5 cm，帶腋芽芽點）、葉片（帶葉柄）接種至含有不同質量濃度 EBR（0，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0 mg/L)和NAA（0，0.1 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，并進行多次重復試驗。

1.3.1 幼苗 每瓶接種3～5個，記錄生根啟動天數、平均生根天數（即當根滿足根條數＞5條、根長度＞4 cm時的天數），10 d后統(tǒng)計生根頻率以及幼苗的平均不定根數。

1.3.2 莖段 每培養(yǎng)皿接種10個，記錄生根啟動天數，10 d后統(tǒng)計生根頻率以及不定芽誘導率。

1.3.3 葉片 每培養(yǎng)皿接種10個，記錄生根啟動天數，15 d后統(tǒng)計生根頻率。

1.4 數據統(tǒng)計

數據統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2013和IBM SPSSStatistics Version 20軟件進行。

2 結果與分析

2.1 大西洋馬鈴薯幼苗的不定根離體發(fā)生情況

將長勢良好的幼苗轉接至不定根離體誘導的培養(yǎng)基中3～7 d后，幼苗陸續(xù)出現不定根。從表1可以看出，與不添加植物生長調節(jié)劑的處理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的處理，啟動時間和平均生根天數均較短，生根頻率和平均不定根數均有所增加，且只添加0.1 mg/L NAA的處理效果更明顯（圖1-A，B，C）。當NAA質量濃度為0.1 mg/L時，隨著EBR質量濃度的升高，不定根發(fā)生的啟動天數逐漸減少，平均生根天數先減少后增加、生根頻率以及平均不定根數先升高后下降。當EBR質量濃度為0.01 mg/L，NAA質量濃度為0.1 mg/L時，幼苗不定根誘導效果最佳，啟動時間約為4 d左右，平均生根天數約10 d，生根頻率可達99.39%，幼苗平均不定根數為11.93條，根較健壯，根系較發(fā)達，有利于提高后續(xù)的移栽存活率（圖1-D）。EBR質量濃度為0.05 mg/L，NAA質量濃度為0.1mg/L的處理，與EBR質量濃度為0.01mg/L，NAA質量濃度為0.1 mg/L的處理相比，啟動時間和平均生根天數相近，差別不大，生根頻率和幼苗平均不定根數略低，但其根系有大量側根發(fā)生，可增加移栽后與土壤的接觸面積，提高移栽成活率（圖1-E）。而當EBR質量濃度為0.1 mg/L或大于0.1 mg/L時，生根效果不理想，甚至出現抑制生根現象（圖 1-F，G，H）。

因此，誘導大西洋馬鈴薯幼苗不定根離體發(fā)生的最佳培養(yǎng)基配方為MS＋0.01 mg/LEBR＋0.1 mg/L NAA。

表1 不同植物生長調節(jié)劑組合對大西洋馬鈴薯幼苗不定根離體發(fā)生的影響

2.2 大西洋馬鈴薯莖段的不定根離體發(fā)生情況

將長勢良好的莖段轉接至不定根離體誘導的培養(yǎng)基中3～7 d后，莖段陸續(xù)出現不定根。

由表2可知，與不添加植物生長調節(jié)劑的處理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的處理，啟動時間均有所減少，生根頻率和平均不定根數均有所增加，其中，以只添加0.1 mg/L NAA的處理生根頻率較高，為68.33%；以只添加0.01mg/LEBR的處理不定芽誘導率較高，為45.16%（圖 2-A，B，C）。

當NAA質量濃度為0.1 mg/L時，隨著EBR質量濃度的升高，莖段不定根發(fā)生的啟動天數逐漸減少，生根頻率和不定芽誘導率先升高后下降。EBR質量濃度為0.01 mg/L，NAA質量濃度為0.1 mg/L的處理和EBR質量濃度為0.05 mg/L，NAA質量濃度為0.1 mg/L的處理生根頻率均較高，分別為99.49%和99.10%，但后者的不定芽誘導率最高，為81.07%，且芽較健壯（圖2-D，E）。而當EBR質量濃度較高時，生根頻率明顯降低，不定芽誘導效果也減弱（圖2-F，G，H）。

可見，當NAA質量濃度為0.1 mg/L時，低質量濃度的EBR對莖段的不定根發(fā)生有促進作用；但當質量濃度較高時，出現抑制生根現象；此外，EBR在誘導不定芽方面有促進作用。

因此，誘導大西洋馬鈴薯莖段的最佳培養(yǎng)基配方為MS＋0.05 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA。

表2 不同植物生長調節(jié)劑組合對大西洋馬鈴薯莖段不定根離體發(fā)生的影響

2.3 大西洋馬鈴薯葉片的不定根離體發(fā)生情況

將長勢良好的葉片轉接至不定根離體誘導的培養(yǎng)基中5～10 d后，葉片陸續(xù)出現不定根。從表3可以看出，與不添加植物生長調節(jié)劑的處理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的處理，啟動時間有所減少，生根頻率有所增加，且只添加0.1 mg/L NAA的處理效果更明顯（圖3-A，B，C）。當NAA質量濃度為0.1 mg/L時，隨著EBR質量濃度的增加，葉片的生根頻率先升高后降低；當EBR質量濃度為0.05 mg/L時，葉片生根頻率最高，為82.06%，且根較粗壯，長勢良好（圖3-E）；但當EBR質量濃度高于0.05 mg/L時，葉片生根頻率均較低，且根較細短，且隨著EBR質量濃度的增加，葉片明顯變黃，但仍比不添加植物生長調節(jié)劑的處理生根效果好（圖3-F，G，H）。可見，EBR對馬鈴薯葉片的生根有一定的促進作用，低濃度的EBR能有效加強促進生根的效果。因此，誘導大西洋馬鈴薯葉片不定根離體發(fā)生的最佳培養(yǎng)基配方為MS＋0.05 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA。

表3 不同植物生長調節(jié)劑組合對大西洋馬鈴薯葉片不定根離體發(fā)生的影響

3 結論與討論

將2，4-表油菜素內酯與馬鈴薯的離體再生相結合，為馬鈴薯不定根快速誘導提供了新的途徑。本研究結果表明，適當濃度的2，4-表油菜素內酯對馬鈴薯不定根的發(fā)生有促進作用，幼苗在MS＋0.01 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA培養(yǎng)基中，生根頻率可達到99.39%，每個無菌苗的平均不定根數為11.93條，且在2，4-表油菜素內酯作用下，幼苗的不定根發(fā)生的啟動時間均較短，為3～5 d，最佳平均生根天數約為10 d。鮑紅春等[9]以馬鈴薯品種隴薯5號的莖段為起始外植體，將其分化出來的健壯小苗在誘導生根時，15 d左右可觀察到根的發(fā)生。白穎等[10]以馬鈴薯加工品種Shepody葉片、莖段為外植體，其不定芽長到2～3 cm時，將其剪下，置于MS基本培養(yǎng)基中，約10 d時可產生不定根，20 d時可進行離體擴繁。崔海辰等[11]研究表明，在外植體不定芽長到2～3 cm時，將其剪下，置于生根培養(yǎng)基中大概10 d時可看到不定根產生，到20 d時根的生長量大大增加。可見，在本研究中，2，4-表油菜素內酯的應用可顯著減少馬鈴薯再生苗的生根時間，縮短組培苗滯瓶期，加快煉苗移栽進程，并且適當濃度的2，4-表油菜素內酯可使莖段、葉片直接誘導不定根。這與閆慧芳等[12]對有關油菜素內酯對巨桉組培中不定根誘導的研究結果一致。可嘗試將2，4-表油菜素內酯應用于其他作物的快速發(fā)根上，以縮短生根時間。

李程等[13]研究表明，油菜素內酯化合物是國際上公認的一類高效、無毒的新型植物甾醇類生長激素。其能有效改善高溫、低溫、重金屬、干旱、病菌侵染等多種生物與非生物逆境脅迫對植物體造成的傷害，增強植株對逆境脅迫的耐受力[14-17]。而馬鈴薯雖營養(yǎng)豐富、產量高、生育期短，但其易出現主要由病毒病引起的品種退化問題[18]。據統(tǒng)計，世界每年因病毒病造成的馬鈴薯減產至少在20%以上，嚴重時減產達到80%[19]。將2，4-表油菜素內酯應用于馬鈴薯的離體再生，不僅能縮短組培苗滯瓶期、加快種苗工廠化以及產業(yè)化進程，更有望提高馬鈴薯種苗的抗逆性，增強其對環(huán)境脅迫的抵抗能力，以實現高產優(yōu)質的目標。