天麻素對大鼠恐懼條件化及消退的影響

劉曉艷 黃伏連 陽澤華

（益陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生理學(xué)教研室，湖南 益陽 413000）

天麻是我國傳統(tǒng)中藥材，為蘭科天麻屬植物天麻的塊莖，《本草綱目》記載天麻能治療“語多恍惚，善驚失忘”等癥。天麻素是從天麻中提煉出的主要活性成分，化學(xué)名稱：4-羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷半水合物，分子式為C13H18O7.1/2H2O，分子量為295.29[1]。有研究證明天麻素可以保護(hù)缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，影響海馬突觸的形成，改善學(xué)習(xí)記憶等作用[2-4]。目前臨床上常將天麻素注射液和片劑用于中風(fēng)、神經(jīng)衰弱等疾病的防治[5-6]。 恐懼條件化模型是研究創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的典型動物模型，本研究擬觀察天麻素對大鼠恐懼條件化及消退的影響，具有一定的臨床參考意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：清潔級成年雄性SD大鼠16只（購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司），體質(zhì)量260～300 g，單籠飼養(yǎng)，溫度濕度恒定，自由取食飲水，自然光照循環(huán)。

1.2 實驗藥物：天麻素注射液由上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司提供。天麻素注射液及生理鹽水通過腹腔注射的方式干預(yù)。

1.3 實驗裝置：行為實驗在條件化箱構(gòu)成的場景中進(jìn)行（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號ZH-KJ）。條件化箱無頂（40 cm×40 cm×50 cm），為黑色不透明的有機玻璃材料，地板由直徑為8 mm的23根銅桿構(gòu)成，每兩根銅桿間距相隔1.5cm，銅桿與電刺激器相連，可提供電擊。條件化置于尺寸為50 cm×50 cm×60 cm的隔音柜中。隔音柜內(nèi)背面安裝風(fēng)扇，提供65 dB的白噪聲。隔音柜天花板上固定音箱以提供聲音刺激，柜內(nèi)由15 W白熾燈照明。計算機程序控制聲、電刺激的呈現(xiàn)。每只大鼠放入條件化箱之前，用75%的酒精溶液擦拭條件化箱。

1.4 實驗程序：天麻素組連續(xù)7 d腹腔注射天麻素，每天2次（劑量為20 mg/kg），生理鹽水組連續(xù)7 d腹腔注射生理鹽水，每天2次（劑量為2 mL/kg）。

行為學(xué)實驗分四個階段進(jìn)行，每個階段天麻素組與生理鹽水組處理相同。第1天進(jìn)行習(xí)慣化，每只大鼠分別單獨適應(yīng)條件化箱20 min。第2天進(jìn)行恐懼條件化訓(xùn)練，動物放入條件化箱180 s后第一次呈現(xiàn)聲音（4 kHz，80 dB，持續(xù)20 s），在聲音結(jié)束前1 s呈現(xiàn)電擊（0.7 mA，持續(xù)1 s），電擊與聲音同時結(jié)束，聲音與電擊配對呈現(xiàn)5次，相鄰兩次聲音間隔時間為90 s，第5次聲音結(jié)束60 s后將大鼠從條件化箱取出放回鼠籠。第3天恐懼條件化檢測，也是消退訓(xùn)練階段，動物放入條件化箱180 s后第一次呈現(xiàn)聲音（4 kHz，80 dB，持續(xù)20 s），沒有電擊，呈現(xiàn)10次，相鄰兩次聲音間隔60 s，第10次聲音結(jié)束60 s后將大鼠放回鼠籠。第4天進(jìn)行消退記憶再現(xiàn)檢測，方法與消退訓(xùn)練階段相同。

僵直是嚙齒類動物面臨傷害性刺激時特有的行為反應(yīng)，表現(xiàn)為動物除呼吸運動外，沒有其他任何動作，處于靜止的狀態(tài)。在實驗過程中用秒表記錄每次聲音呈現(xiàn)時或?qū)⒋笫笾糜诳謶謼l件化相同場景時大鼠的僵直時間，是目前檢測恐懼行為常用的指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)處理：條件化過程中的每次聲刺激和電擊配對稱為一個trial，消退訓(xùn)練和檢測過程中，每次聲音呈現(xiàn)稱為一個trial。采用雙因素重復(fù)測量的方差分析對線索性恐懼條件化階段、消退訓(xùn)練階段、消退檢測階段的僵直時間百分比進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用兩個獨立樣本的t檢驗對恐懼條件化階段前180 s的僵直時間百分比進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié) 果

恐懼條件化階段，天麻素組與生理鹽水組大鼠僵直時間百分比無顯著性組間差異，但天麻素組與生理鹽水組大鼠僵直時間百分比組內(nèi)差異顯著（P＜0.05），表明獲得了同等程度的條件化恐懼（圖1）?？謶謼l件化后24 h，給予大鼠消退訓(xùn)練，隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，兩組大鼠的僵直時間百分比逐漸下降，組間差異不顯著，但天麻素組與生理鹽水組大鼠僵直時間百分比組內(nèi)差異顯著（P＜0.05），表明兩組大鼠獲得同等程度的消退（圖2）。消退訓(xùn)練后24 h，再給予大鼠10次單獨聲刺激呈現(xiàn)，以檢測消退記憶的保持，兩組大鼠的僵直時間百分比都隨著訓(xùn)練次數(shù)增加而顯著性下降，組間差異不顯著，但天麻素組與生理鹽水組大鼠僵直時間百分比組內(nèi)差異顯著（P＜0.05，圖3）。以上結(jié)果表明天麻素處理對大鼠的恐懼條件化、由聲音誘導(dǎo)的線索性恐懼消退及記憶再現(xiàn)沒有影響。

圖1 Percent freezing of gastrodin and saline group during fear conditioning（ ±s，n=8）Sal=Saline group，Gas=Gastrodin group.

圖2 Percent freezing of gastrodin and saline group during fear extinction training（±s，n=8）Sal=Saline group，Gas=Gastrodin group.

圖3 Percent freezing of gastrodin and saline group during fear extinction test （±s，n=8）Sal=Saline group，Gas=Gastrodin group.

圖4 Percent freezing during 180 second duration before the first tone presentation during fear extinction（±s，n=8）Sal=Saline group，Gas=Gastrodin group.*P＜0.05 vs control

通過組間t檢驗分析表明：在恐懼消退訓(xùn)練階段第一次聲音呈現(xiàn)前180 s檢測箱場景誘發(fā)的僵直時間百分比，天麻素組僵直時間百分比顯著高于生理鹽水組（P＜0.05，圖4）。表明天麻素處理影響了大鼠的長時程場景性恐懼記憶的形成。

3 討 論

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動物模型中較為典型的是恐懼條件化模型，該模型主要研究恐懼記憶的獲得及消退的一系列過程[7]?？謶钟洃浀南瞬⒉皇呛唵蔚膶謶钟洃浀倪z忘，其本質(zhì)是恐懼記憶與消退記憶競爭出現(xiàn)，所以恐懼消退是一種新的學(xué)習(xí)過程。動物研究證實前額葉、杏仁核、海馬等多個腦區(qū)參與了恐懼記憶的形成、消退及再鞏固過程[8-9]。當(dāng)恐懼消退再現(xiàn)過程受阻將會引起神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，比如個體在經(jīng)歷了強烈的創(chuàng)傷性事件后，當(dāng)其再次暴露在遭受創(chuàng)傷時相似的情境中，會出現(xiàn)以恐懼記憶重復(fù)體驗為核心癥狀的反應(yīng)性精神障礙，稱為創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）[10]。削弱創(chuàng)傷性恐懼記憶再鞏固是PTSD重要治療方法之一。有研究顯示，天麻素可以通過調(diào)節(jié)GABA能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)揮一定的抗焦慮作用[11-12]，并可以提高學(xué)習(xí)能力和促進(jìn)記憶的形成和鞏固[13]。我們的結(jié)果顯示天麻素處理對大鼠的恐懼條件化、由聲音誘導(dǎo)的線索性恐懼消退及記憶再現(xiàn)沒有影響，但影響了大鼠的長時程場景性恐懼記憶的形成。海馬為學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，場景恐懼記憶的產(chǎn)生依賴于海馬，同時海馬也在應(yīng)激調(diào)節(jié)中起重要作用[14-15]。有動物實驗表明，在應(yīng)激狀態(tài)下，機體通過大量釋放糖皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素等，或是抑制神經(jīng)發(fā)生、5-HT受體功能及腦源性營養(yǎng)因子，或是損害長時程增強[16-18]等途徑對海馬造成影響。天麻素對大鼠長時程場景性恐懼記憶的形成是否通過以上某一途徑來影響海馬的功能，有待進(jìn)一步的實驗來證實。