HPV-16 E7負載DC激活CIK細胞增強宮頸癌細胞殺傷效應的研究

陸暢暢 續力云 吳麗萍

流行病學調查發現，人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸鱗狀上皮病變的必要因素[1]。持續性高危型HPV感染（如 HPV-16、-18、-31、-33 和-58）是宮頸癌發生、發展的必要前提[2]。HPV早期區E6、E7基因編碼蛋白是非常理想的宮頸癌治療性靶蛋白，因為它們僅由病毒蛋白構成，卻可在宿主細胞中表達；因此，一旦破壞體內表達HPV E6、E7蛋白的細胞，就能阻止腫瘤的發生，同時破壞已經癌變的腫瘤組織，而這樣的治療策略的實施依賴于細胞免疫的參與[3-4]。樹突狀細胞（DC）作為人體內已知的抗原遞呈能力最強的抗原遞呈細胞，成為當前抗病毒免疫和腫瘤免疫治療的研究熱點之一[5]。DC能攝取、加工抗原，表達高水平主要組織相容性復合體（MHC）等有助于抗原提呈的分子，有效地向T淋巴細胞提呈抗原，啟動患者自身特異性免疫反應。細胞因子誘導的殺傷（CIK）細胞是新型的免疫活性細胞，是由多種細胞因子誘導產生的殺傷細胞；其兼具T淋巴細胞強大的殺傷活性和NK細胞的非MHC限制性殺傷特點[6-7]。然而，目前臨床無論是DC疫苗還是CIK細胞單獨應用于抗腫瘤或抗病毒治療，效果均不是特別理想[8-9]。負載靶抗原的DC與CIK細胞聯合應用時，DC可增強CIK細胞的免疫應答，CIK細胞的非MHC限制性可彌補DC MHC限制性的不足，兩者的互補作用產生雙重殺傷效應[10-11]。因此，抗原致敏DC-CIK細胞的聯合應用，是宮頸癌細胞免疫治療的有益探索。本研究應用流式細胞術、ELISA法檢測HPV-16 E7負載DC對CIK細胞表型及細胞因子分泌水平的影響，乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測HPV-16 E7負載DC-CIK細胞對宮頸癌細胞的殺傷活性，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 細胞因子：IL-2、IL-4、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN-γ及IL-1α購自美國Pepro Tech公司。單克隆流式抗體：抗人PE-CD3、FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8、FITC-CD14、FITCCD56、APC-CD83、PerCP-Cy5.5-CD86和 PE-HLA-DR單抗，同型對照抗體 APC-IgG1、FITC-IgG2a、PE-IgG1及PerCP-Cy5.5-IgG1均購自美國BD公司。Alys-505培養液、RPMI 1640培養基、FBS、杜氏磷酸緩沖液（DPBS）、PBS購自美國Gbico公司。ELISA法檢測IL-12、IFN-γ、TNF-α的試劑盒均購自美國R&D公司。人外周血淋巴細胞分離液購自中國天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。CytoTox 96R非放射性細胞毒性檢測試劑盒（CytoTox 96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay）購自美國Promega公司。HPV-16 E7載體與陰性對照載體購自上海吉瑪公司。宮頸癌Hela細胞株購自中國科學院干細胞庫。FACS CaliburTM流式細胞儀為美國BD公司產品，酶標儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DC的分離培養 抽取26例健康志愿者外周血各 20ml，肝素抗凝，離心 900g，30min；吸取上層血漿，置于 56℃水浴鍋中 30min，隨后 4℃靜置 15min，離心800g，15min；取上層血漿4℃保存備用。另取離心后細胞沉淀，加D-PBS混勻，緩慢加到裝有10ml淋巴細胞分離液的離心管中，室溫離心吸取白膜層細胞，用含10%血漿的Alys-505培養液重懸細胞，以5×106/ml細胞密度接種于6孔板，于飽和濕度、37℃、5.0%二氧化碳培養箱中培養2h。保留貼壁細胞于6孔板中，于含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4及10%血漿的Alys-505培養液中繼續培養，此即為分離的DC，第3天時半量換液并補充新鮮的細胞因子。

1.2.2 CIK細胞的誘導培養 取DC的分離培養過程中未貼壁細胞，用含0.5%血漿的Alys-505培養液調整細胞密度為1×106/ml，轉入6孔板，同時每孔添加1000U/ml的IFN-γ，置于飽和濕度、37℃、5.0%二氧化碳培養箱中培養。24h后，每孔分別加入50ng/ml CD3單抗，1000U/ml IL-2及1000U/ml IL-1α繼續培養。每3d調整細胞密度為1×106/ml，于含1000U/ml IL-2及0.5%血漿的Alys-505培養液中培養，第8天收獲CIK細胞。

1.2.3 DC-CIK細胞的共培養 將分離的DC與誘導的CIK細胞以1∶10比例共同培養，每2d補充含0.5%血漿、1000U/ml IL-2、100ng/ml GM-CSF 的 Alys-505培養液，共培養5～7d后收獲DC-CIK細胞備用。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞表型

1.2.4.1 HPV-16 E7負載DC細胞表型檢測 應用HPV-16 E7載體與陰性對照載體轉染DC，取轉染后第3天的 DC 2×106個，重懸于 200μl PBS，均分入 2管。對照管添加1μl熒光素標記的同型對照抗體（APC-IgG1、FITC-IgG2a、PE-IgG1 及 PerCP-Cy5.5-IgG1），實驗管添加 1μl熒光素標記的抗人抗體（APC-CD83、FITCCD14、PE-HLA-DR 及 PerCP-Cy5.5-CD86）。室溫避光孵育 30min，分別加 1ml PBS，離心 400g 5min，棄 PBS，重復3次，最后以500μl PBS重懸細胞，上機檢測HPV-16 E7負載DC細胞與陰性對照負載DC細胞表型。

1.2.4.2 HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞表型檢測 取最終培養的HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞各4×106個，重懸于 400μl PBS，均分入 a、b、c、d 管，a 管添加 1μl熒光素標記的同型對照抗體（PE-IgG1、FITC-IgG2a），b管添加1μl熒光素標記的同型對照抗體（FITC-IgG2a、APC-IgG1、PE-IgG1），c 管添加 1μl熒光素標記的抗人抗體（PE-CD3、FITC-CD56），d管添加 1μl熒光素標記的抗人抗體（FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8）。室溫避光孵育30min，以上各管各添加1ml PBS，離心400g 5min，棄PBS，重復3次，500μl PBS重懸沉淀，應用 FACS CaliburTM流式細胞儀進行檢測，FlowJo軟件（美國）進行數據分析。

1.2.5 HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞的細胞因子表達水平檢測 采用ELISA法檢測細胞培養上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平。具體步驟參照試劑說明書，繪制吸光值（OD值）與樣本濃度的標準曲線，根據標準曲線確定樣品濃度。

1.2.6 HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞對宮頸癌Hela細胞的殺傷活性檢測 采用LDH釋放法。以含5%FBS RPMI 1640培養基懸浮的Hela細胞作為靶細胞，加入96 孔板，每孔 1×104個細胞/50μl。以 HPV-DC-CIK、DC-CIK、CIK細胞為效應細胞，按不同效靶比加入相應數量的效應細胞50μl。另設培養基對照孔，效、靶細胞自然釋放孔，靶細胞最大釋放孔，各組均設3個復孔。具體步驟參照試劑說明書，最后，根據孔內于490nm處測吸光值（OD值）計算各組CIK細胞殺傷活性，殺傷活性（%）=（實驗組OD值-靶細胞自然釋放組OD值-效應細胞自然釋放組OD值）/（靶細胞最大釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值）×100%。

1.3 觀察指標 （1）比較HPV-16 E7負載DC與陰性對照負載DC表型；（2）HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞表型；（3）比較HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞分泌的細胞因子水平；（4）比較HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞對宮頸癌Hela細胞的殺傷活性。1.4 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV-16 E7負載DC與陰性對照負載DC表型比較見表1。

表1 HPV-16 E7負載DC與陰性對照負載DC表型比較（n=26，%）

由表1可見，與陰性對照負載DC比較，HPV-16 E7 負載 DC 中 CD83+、CD86+、HLA-DR+DC 細胞比例均上調（均P＜0.05），CD14+DC 細胞比例下調（P＜0.05）。2.2 HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DCCIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞表型比較見表2。

表2 HPV-16E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞表型比較（n=26，%）

由表2可見，HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞的細胞表型比較均有統計學差異（均P＜0.05）。與其他3組細胞比較，HPV-16 E7負載DC-CIK細胞中CD3+CD4+CIK 細胞比例下調（P＜0.05），CD3+CD8+、CD3+CD56+CIK細胞比例均上調（均P＜0.05）。

2.3 HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞分泌的細胞因子水平比較見表3。

表3 HPV-16E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞分泌的細胞因子水平比較（n=26）

由表3可見，HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞中L-12、IFN-γ、TNF-α水平比較均有統計學差異（均P＜0.05）。與其他3組細胞比較，HPV-16 E7負載DC-CIK細胞 IL-12、IFN-γ、TNF-α 水平均上調（均P＜0.05）。

2.4 HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞對宮頸癌Hela細胞的殺傷活性比較見圖1。

由圖1可見，HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞對宮頸癌Hela細胞的殺傷活性比較差異有統計學意義（P＜0.05）。HPV-16 E7負載DC-CIK細胞對宮頸癌Hela細胞的殺傷活性最強（均P＜0.05），DC-CIK細胞次之（P＜0.05）。

圖1 HPV-16 E7負載DC-CIK細胞、陰性對照負載DC-CIK細胞、DC-CIK細胞、CIK細胞對宮頸癌Hela細胞的殺傷活性比較（n=26；CIK細胞 vs DC-CIK細胞，*P＜0.05；陰性對照負載DC-CIK細胞vs HPV-16 E7負載-DC-CIK細胞，**P＜0.01）

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，占全世界婦女癌癥病死率第2位；HPV是宮頸癌的主要致病因子，幾乎所有的宮頸癌發病都與高危型HPV感染有關[1-2]。E6、E7蛋白是高危型HPV的主要致癌蛋白，只表達于HPV感染組織中，在正常組織中不表達，其中E7蛋白主要通過結合并降解成視網膜母細胞瘤蛋白而使其喪失抑癌功能，因此E6、E7蛋白是宮頸癌治療的理想靶蛋白[4,12]。本研究應用HPV-16 E7載體轉染人外周血來源DC，得到HPV16 E7負載DC，并發現HPV16 E7特異性負載可促使DC成熟，與陰性對照負載DC相比，細胞表面標志物CD83、CD86及HLA-DR表達上調，CD14表達下調。CD83、CD86及 HLA-DR分子均為T淋巴細胞活化的標志分子[13-15]，免疫細胞功能的實施與細胞活化狀態密切相關，CD83、CD86及HLA-DR表達上調，利于腫瘤細胞的清除。

CIK細胞是在多種細胞因子即IL-2、IL-1、IFN-γ及抗CD3單克隆抗體等存在的條件下，應用外周血、骨髓或臍血中分離出的單個核細胞，經過一定時間培養而獲得的非MHC限制性的高效溶腫瘤細胞毒性T細胞，在外周血淋巴細胞的比例僅為1%~5%；它兼具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點，在腫瘤免疫治療中起到了不可替代的作用[16-17]。CIK細胞表面不表達Fc受體，不能產生抗體依賴性細胞毒反應，DC與CIK細胞共培養既可發揮CIK的非限制性細胞毒反應，又可激發抗原負載的DC介導的MHC限制性細胞毒反應，增強特異性殺傷作用。研究表明，經DC刺激后的CIK細胞活性顯著增強[10-11]。本研究結果也發現，經過HPV-16 E7負載DC共培養的CIK細胞，CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞比例均上調，細胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-α 的水平亦均上調，CIK 細胞表現出更強的宮頸癌Hela細胞殺傷活性。

綜上所述，HPV-16 E7負載DC不僅能激活CIK細胞，還可增強CIK細胞的宮頸癌細胞殺傷效應。HPV-16 E7負載DC與CIK細胞的協同作用對宮頸癌的細胞免疫治療具有重要意義。