VEGF與Notch信號通路對再生障礙性貧血患者骨髓間充質干細胞的調控機制研究

鄧姝 項靜靜 胡致平 沈建平 曾宇晴

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種由多種病因引起的骨髓造血功能衰竭、全血細胞減少性疾病，臨床常表現為貧血、出血及感染，病死率高。骨髓造血微環境的改變參與了AA的病理生理過程，并與造血衰竭程度[1]及治療反應有關。骨髓中新生血管形成是造血微環境的重要一環。研究發現，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）可直接作用于內皮細胞，參與新生血管形成；Notch信號通路通過影響局部細胞間的相互作用也對血管的形成產生重要影響。但VEGF如何影響AA患者骨髓造血微環境的作用機制尚未完全闡明。因此，本研究旨在觀察VEGF通過Notch信號通路對AA患者骨髓造血微環境的影響，探討VEGF與Notch信號通路對骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的調控機制，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年7月至2017年2月浙江中醫藥大學附屬第一醫院收治的AA患者10例。其中男4例，女6例；年齡15~46歲，中位年齡26.5歲。同時招募健康骨髓造血干細胞捐獻志愿者5例。本研究經浙江中醫藥大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準，患者或家屬及志愿者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 MSC的分離、培養、傳代及鑒定 留取AA患者與健康志愿者的骨髓標本各5ml。骨髓標本與DMEM（美國Hyclone公司）1：1混勻添加到淋巴細胞分離培養基上（美國Sigma公司），并通過離心機（上海貝恩生物科技有限公司）分離。將骨髓單個核細胞重懸于DMEM培養基中，并以1×105/ml的密度接種于培養瓶中。在37℃、5%二氧化碳條件下培養48h后更換培養基。每3~4d換液1次，約2周后完成原代培養，并依次記為P2、P3代細胞。取P3代細胞應用流式細胞儀（美國BD公司）檢測細胞免疫表型，包括 CD34、CD44、CD45、CD90 等。1.2.2 細胞分組 將MSC分為5組。正常MSC組：健康志愿者的MSC于DMEM完全培養基中培養。AA組：AA患者的MSC于DMEM完全培養基中培養。AA+γ-分泌酶抑制劑（DAPT）組：AA患者的MSC于含有10μmol/L DAPT（美國Sigma公司)的DMEM完全培養基中培養；AA+VEGF組：AA患者的MSC于含有100ng/ml VEGF（美國Peprotech公司）的DMEM完全培養基中培養；AA+DAPT+VEGF組：AA患者的 MSC于含有10μmol/LDAPT和100ng/ml VEGF的DMEM完全培養基中培養。

1.2.3 細胞增殖檢測 使用CCK-8試劑盒（中國碧云天公司）檢測各組MSC的增殖能力。將各組MSC接種在 96孔板（100μl/孔）中，并在 37℃、5%二氧化碳環境中培養直至完全黏附。處理48h后，向每孔中加入10μl CCK-8溶液并孵育2h。應用酶標儀（美國Thermo Scientific公司）檢測450nm處的光密度（OD值）以反映細胞增殖能力。

1.2.4 細胞周期檢測 應用流式細胞儀（美國BD公司）檢測各組MSC的細胞周期。以1500rpm離心5min收集細胞，并用冷PBS洗滌2次。在細胞周期檢測過程中，將經消化的MSC用5ml 70%冷乙醇溶液在4℃下固定，過夜；用冷PBS洗滌2次，將這些細胞與0.5ml碘化丙啶（PI，美國Sigma公司）在黑暗環境中孵育20min，最后在流式細胞儀上分析細胞的細胞周期。

1.2.5 相關蛋白表達檢測 采用Western blot法。收集各組細胞，PBS漂洗2次，細胞裂解液（中國碧云天公司）4℃環境下裂解細胞 30min，12000rpm 4℃離心10min，使用BCA蛋白濃度測定試劑（中國碧云天公司）檢測蛋白含量。取30μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAG，北京普利萊基因技術公司）電泳分離后，轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉室溫封閉1h。一抗孵育，于4℃環境中過夜，用TBST（上海百賽公司）洗膜3次，加入二抗室溫孵育1h后，再用TBST洗膜3次，ECL化學發光顯影，檢測VEGF蛋白與Notch信號通路相關蛋白表達情況，包括 VEGF、VEGFR、Cleaved Notch-1、Notch-1、Jagged1、Delta-like1、hes1。

1.2.6 相關基因表達檢測 采用qRT-PCR法。收集正常MSC組與AA組細胞，嚴格按照Trizol試劑盒（北京全式金公司）說明書操作提取總RNA。取100ng總RNA，采用PrimeScipt逆轉錄試劑盒（日本Takara公司)進行逆轉錄，反應條件為37℃ 60min，85℃ 5s，逆轉錄完成后進行qRT-PCR，反應條件為50℃ 2min，預變性95℃ 30s，PCR 反應 95℃ 5s，60℃ 30s，40 個循環，熔解反應條件為95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。引物序列如下：VEGF 上游 5′-ACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3′，下游 5′GGCTTGAAGATGTACTCGAT-3′；VEGFR 上游 5′-TCCTGACTTGTACCGCATAT-3′，下游 5′-CTCTCAATTCTGTTTCCCAT-3′；Notch-1 上游 5′-TGGCCTCCTTCTACTGCGAG-3′，下游 5′-CAGTTGGAGCCCTCGTTACA-3′；Jagged1 上游 5′-CGGATTTAAGTGTGTGTGCC-3′，下游 5′-CGGGAAGACAGTCGCAGTAG-3′；Delta-like1 上游 5′-TCTCCTGATGACCTCGCA AC-3′，下游 5′-GTCACA-CACGAAGCGGTAGG-3′；hes1 上游5′-GATCTTTGC-TCCTGACGTCC-3′，下游 5′-CCTTGCAATCTTTCCCGTCC-3′；GAPDH 上游 5′-GCCTTCCGTGTCCCCACTGC-3′，下游 5′-GGCTGGTGGTCCAGGGGTCT-3′。反應結束后導出數據，并分析VEGF與Notch信號通路相關基因mRNA的相對表達水平。

1.2.7 內皮分化能力檢測 采用免疫熒光法。吸棄正常MSC組、AA組、AA+DAPT組細胞培養上清液，加PBS清洗2次；用4%多聚甲醛固定各組細胞，4℃環境下過夜，PBS 清洗 3 次，各 5min；1%TritonX-100（上海朝瑞公司，PBS配制）孵育1次 15min，PBS清洗1次，5min；孵育 10min，PBS清洗 1次，5 min；5%牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma公司）封閉30min，配制一抗稀釋液（1：100）CD31一抗4℃環境下過夜；PBS清洗3次，各5 min，37℃孵育 2h；PBS 清洗 3 次，各 5min，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，中國碧云天公司）染核5~10min，PBS洗3次，熒光顯微鏡拍照，比較細胞內皮分化能力。

1.3 觀察指標 （1）比較AA患者與健康志愿者MSC免疫表型；（2）比較正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC增殖能力、細胞周期情況、VEGF蛋白與Notch信號通路相關蛋白表達情況；（3）比較AA組與正常MSC組MSC VEGF與Notch信號通路相關基因mRNA表達情況；（4）比較正常MSC組、AA組、AA+DAPT組MSC內皮分化能力。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AA患者與健康志愿者MSC免疫表型比較見表1。

表1 AA患者與健康志愿者MSC免疫表型比較（%）

由表1可見，AA患者與健康志愿者MSC免疫表型比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC增殖能力比較見圖1。

圖1 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF（*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖1可見，正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC細胞增殖能力比較差異有統計學意義（P＜0.05）；AA組MSC增殖能力弱于正常MSC組（P＜0.05），AA+VEGF組MSC增殖能力強于AA組（P＜0.05）。即AA患者MSC增殖能力弱于正常MSC細胞，經過VEGF處理后，AA患者MSC增殖能力增強。

2.3 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC細胞周期情況比較見圖2。

圖2 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC細胞周期情況比較

由圖2可見，與正常MSC組相比，AA組MSC G1期細胞比例降低，S期細胞比例增加，G2期無明顯變化，說明細胞阻滯在S期，增殖能力減弱。與AA組相比，AA+VEGF組MSC G1期細胞比例無明顯變化，S期細胞比例降低，G2期細胞比例增加，說明細胞進入G2期，增殖能力增強。與AA+VEGF組相比，AA+DAPT+VEGF組MSC G1期細胞比例無明顯變化，S期細胞比例增加，G2期細胞比例降低，說明細胞阻滯在S期，增殖能力減弱。即AA患者MSC細胞增殖能力弱于正常MSC細胞，VEGF通過阻斷S期細胞促進AA患者MSC的增殖，抑制其凋亡。

2.4 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC VEGF蛋白與Notch信號通路相關蛋白表達情況比較見圖3。

圖 3 正常 MSC組、AA組、AA+DAPT組、AA+VEGF組、AA+DAPT+VEGF組MSC VEGF蛋白與Notch信號通路相關蛋白表達情況比較

由圖3可見，與正常MSC組相比，AA組MSC VEGF、VEGFR、Cleaved Notch-1、Notch-1、Jagged1、Deltalike1、hes1蛋白表達均下調。與AA組相比，AA+VEGF組 MSC VEGF、VEGFR、Cleaved Notch-1、Notch-1、Jagged1、Delta-like1、hes1蛋白表達均上調。與AA+DAPT組比較，AA+DAPT+VEGF組 MSC Cleaved Notch-1、Notch-1、Jagged1、Delta-like1、hes1 蛋白表達上調，但低于AA+VEGF組。

2.5 AA組與正常MSC組MSC VEGF與Notch信號通路相關基因mRNA表達情況比較見圖4。

圖4 AA組與正常MSC組MSC VEGF與Notch信號通路相關基因 mRNA 表達情況比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖4可見，與正常MSC組相比，AA組MSC VEGF、VEGFR、Notch-1、Jagged1、Delta-like1、hes1 基因 mRNA表達均下調。即AA患者的MSC Notch信號通路與VEGF表達受抑制。

2.6 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組MSC內皮分化能力比較見圖5。

圖5 正常MSC組、AA組、AA+DAPT組MSC內皮分化程度比較（免疫熒光染色，×200）

由圖5可見，與正常MSC組相比，AA組MSC CD31陽性細胞比例明顯降低，說明內皮分化程度降低。與AA組相比，AA+DAPT組MSC CD31陽性細胞比例降低，說明內皮分化程度降低。即AA患者MSC內皮分化能力弱于正常MSC，DAPT可進一步抑制MSC內皮分化。

3 討論

AA是血液系統常見疾病，有研究認為其與造血干細胞內在增殖或分化缺陷，骨髓造血微環境異常及機體免疫功能紊亂有關，3種機制在不同個體單獨或聯合作用，導致造血功能衰竭[1]。目前認為，AA是一種以造血系統為靶目標的自身免疫性疾病。造血干細胞無細胞及分子遺傳學異常，因此骨髓衰竭的始動因素應該來源于造血微環境而非造血干細胞。研究表明，MSC作為骨髓基質細胞的前體細胞，是一類具有自我更新能力和免疫調節作用的干細胞，是骨髓造血微環境的重要組成部分，其通過介導造血干細胞黏附，分泌多種細胞因子和生長因子而發揮造血支持作用[2-4]。AA患者MSC的異常可能在其發病機制中產生重要作用[5-7]。

臨床上發現，AA患者血清VEGF水平明顯低于正常人。其降低的機制可能是患者的骨髓造血功能障礙，骨髓血管減少，血管通透性降低，供血、供氧量減少，VEGF分泌減少，進一步地加速了骨髓的脂肪化。AA患者血清VEGF水平的降低可能成為導致干細胞集落形成能力降低以及骨髓微環境支持功能缺陷的因素之一。有研究報道，AA患者的VEGF表達低于正常對照組，VEGF對大鼠MSC有明確的促增殖作用，其作用機制與Notch信號通路密切相關[8]。Notch信號通路對血管的發育和形成起重要的調控作用，其間涉及到Notch信號通路與MSC間復雜的關系，但具體的調控機制尚未完全闡明[9]。

Notch信號通路是一個在進化上高度保守的信號傳導系統，廣泛存在于所有已知動物細胞中，調控著幾乎所有的組織和器官細胞的增殖、分化與凋亡。鑒于Notch信號通路在調節造血干細胞和骨髓基質細胞的功能中起到的重要作用，研究發現，多種血液惡性疾病的Notch信號通路存在異常，影響疾病的發生、發展過程[10]。研究發現，Notch信號通路導致AA的發生，可能與從TBX21下調Notch-1有關[11]。Notch信號通道參與MSC向軟骨細胞分化的過程，對于單層培養MSC，γ-分泌酶抑制劑DAPT可抑制Notch信號通道，不僅可抑制MSC的增殖，亦可抑制MSC成軟骨分化[12]。Notch被認為是AA發病機制的主要驅動因子。據報道，Notch信號通路參與調節AA小鼠模型中的Treg/Th17平衡[13]。

本研究結果顯示，AA患者MSC的Notch信號通路受抑制，MSC內皮分化能力弱于正常MSC細胞，而VEGF通過激活Notch信號通路可促進AA患者MSC的增殖。此外，本研究還發現，VEGF可通過阻斷S期細胞促進AA患者MSC的增殖，抑制其凋亡。VEGF的干預可以恢復AA患者的增殖能力。這說明，VEGF可通過Notch信號通路調控AA患者MSC，從而改善骨髓造血微環境，并與患者造血功能恢復有關。同時本研究結果驗證了AA患者存在骨髓造血微環境異常，這為再障免疫學提供新的理論參考。