外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其變化在局部晚期鼻咽癌療效判斷及預(yù)后預(yù)測中的作用

曾偉華 李微綻 鄒國榮 曹小龍 何艷 李娟 蘇珍 唐杰

【摘要】 目的：探討外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）及其變化在局部晚期鼻咽癌療效判斷及預(yù)后預(yù)測中的作用。方法：收集2016年6月-2017年6月本院收治的局部晚期鼻咽癌患者60例，利用抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞儀聯(lián)合方法，分別檢測患者在接受治療前、治療后3周及治療后3個月的外周血CTCs數(shù)量，且平均隨訪24個月，對包括CTCs在內(nèi)的預(yù)后因子進(jìn)行統(tǒng)計分析，探索CTCs及其變化與局部晚期鼻咽癌療效、預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果：單因素分析結(jié)果顯示，CTCs水平與N分期明顯相關(guān)（P<0.05）;Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示，CTCs水平與N分期有相關(guān)性（P<0.05），CTCs陽性患者的N分期更晚;與治療前相比，治療后3周、3個月的CTCs數(shù)目及陽性率均顯著降低（P<0.05）;治療后3個月CTCs陰性患者的RR顯著高于CTCs陽性患者（P<0.05）;根據(jù)Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CTCs陽性患者的總生存時間（overall survival，OS）明顯短于CTCs陰性患者，2年總生存率分別為83.26%和91.23%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;且治療后隨訪期間，CTCs陰性組轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率均明顯低于CTCs陽性組（P<0.05）。結(jié)論：外周血CTCs檢測可用于局部晚期鼻咽癌的療效評價，且對患者療效具有一定的預(yù)后預(yù)測價值，可能成為鼻咽癌患者早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展及預(yù)后評估的一個輔助指標(biāo)，進(jìn)而為制定個體化診斷和治療提供可靠依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 局部晚期鼻咽癌 預(yù)后

[Abstract] Objective： To investigate the role of peripheral blood circulating tumor cells （CTCs） and their changes in the evaluation of curative effect and prognosis of locally advanced nasopharyngeal carcinoma. Method： A total of 60 patients with locally advanced nasopharyngeal carcinoma admitted to our hospital from June 2016 to June 2017 were collected. The number of CTCs in peripheral blood of patients before treatment， 3 weeks after treatment and 3 months after treatment were detected by antibody labeling and flow cytometry， and the average follow-up was 24 months， the prognostic factors including CTCs were given statistical analysis， the relationship between CTCs and their changes and the efficacy and prognosis of locally advanced nasopharyngeal carcinoma were analyzed. Result： Univariate analysis showed that CTCs level was significantly correlated with N stage （P<0.05）. Logistic multivariate regression analysis showed that CTCs level was correlated with N stage （P<0.05）， and N stage was later in CTCs positive patients. Compared with before treatment， the number and positive rate of CTCs were significantly decreased after 3 weeks and 3 months of treatment （P<0.05）. RR of CTCs negative patients was significantly higher than that of CTCs positive patients after 3 months of treatment （P<0.05）. According to Kaplan-Meier survival analysis， the total survival time （OS） of CTCs positive patients was significantly shorter than that of CTCs negative patients， and the 2-year overall survival rate were 83.26% and 91.23% respectively， the difference was statistically significant （P<0.05）. Moreover， during the follow-up period after treatment， the recurrence rate of metastasis in the CTCs negative group was significantly lower than that in the CTCs positive group （P<0.05）. Conclusion： The detection of CTCs in peripheral blood can be used to evaluate the curative effect of locally advanced nasopharyngeal carcinoma， and has certain prognostic value for patients， it may be an auxiliary index for early detection of disease progression and prognosis evaluation of nasopharyngeal carcinoma patients， and provide reliable basis for making individualized diagnosis and treatment.

[Key words] Circulating tumor cells Locally advanced nasopharyngeal carcinoma Prognosis

First-authors address： Guangzhou Panyu District Central Hospital， Guangzhou Panyu Area Tumor Research Institute， Guangzhou 511400， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.32.035

鼻咽癌是我國華南地區(qū)的高發(fā)惡性腫瘤之一[1]，發(fā)現(xiàn)時70%已為局部晚期。局部晚期鼻咽癌是指鼻咽腫瘤占據(jù)頸動脈鞘區(qū)，或腫瘤侵犯鼻竇、眼眶、顳下窩、顱底、翼突、翼腭窩及第1～2頸椎之一者，常伴有顱神經(jīng)損害或下頸、鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，病灶侵犯廣泛，極易復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，具有死亡率高、治療效果差、5年生存率低等特點(diǎn)[2]。目前，針對局部晚期鼻咽癌患者的主要模式為以同期放化療輔加新輔助化療或輔助化療的綜合治療[3]。近年來，隨著放射影像、放療技術(shù)、化學(xué)治療的發(fā)展，尤其是調(diào)強(qiáng)放射治療等先進(jìn)的放療技術(shù)應(yīng)用得到普及，局部晚期鼻咽癌患者的生存期及局部控制率得到明顯提高，而放化療后腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成為鼻咽癌治療的主要失敗模式[4]。因此，如何減少此類患者腫瘤的轉(zhuǎn)移成為研究的熱點(diǎn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）理論為醫(yī)務(wù)工作者對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移有了新的認(rèn)識。在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌等實(shí)體腫瘤中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞已被發(fā)現(xiàn)對腫瘤的輔助診斷、療效評價、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測和預(yù)后判斷等有積極的臨床指導(dǎo)意義[5-6]。但現(xiàn)在國內(nèi)尚無足量循環(huán)腫瘤細(xì)胞在鼻咽癌患者中的表達(dá)情況及其與疾病療效判斷及預(yù)后預(yù)測的報道，因此，本研究探討了外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其變化在局部晚期鼻咽癌療效判斷及預(yù)后預(yù)測的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月-2017年6月本院收治的60例局部晚期鼻咽癌患者作為研究對象。60例患者中，男32例，女28例;年齡20～65歲，中位年齡48歲;分期參照AJCC/UICC 7th標(biāo)準(zhǔn)，Ⅲ期33例，ⅣA期17例，ⅣB期10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為初診患者，臨床試驗(yàn)開始前未行放療或化療;病理確診為鼻咽非角化癌（分化型或未分化型，即WHO Ⅱ型或Ⅲ型）;腫瘤分期為T3～4N0～1M0、T1～4N2～3M0，Ⅲ、ⅣA、ⅣB（UICC2010分期）;年齡18～65歲;卡氏評分（Karnofsky scale，KPS）≥70分。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有惡性腫瘤病史或同時患其他臟器惡性腫瘤;伴有嚴(yán)重精神系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重過敏史;合并嚴(yán)重免疫系統(tǒng)或造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病;合并心、肺、腎等重要臟器功能不全;處于妊娠期或哺乳期婦女。研究已取得倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情并簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 （1）誘導(dǎo)化療：所有患者均接受2～3個療程誘導(dǎo)化療，誘導(dǎo)化療方案為TP[多西他賽（生產(chǎn)廠家：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20123222）70 mg/m2，d1，d22，d43，靜滴;順鉑（生產(chǎn)廠家：江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20040813）20 mg/m2，d1～4，d22～25，d43～46，靜滴]、TPF[多西他賽60 mg/m2，d1，d22，d43，靜滴;順鉑20 mg/m2，d1～3，d22～24，d43～45，靜滴;氟尿嘧啶（生產(chǎn)廠家：山西普德藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20051113） 600 mg/m2，d1～5，d22～26，d43～47，靜滴]、PF[順鉑30 mg/m2，d1～3，d22～24，d43～45，靜滴氟尿嘧啶750 mg/m2，d1～4，d22～25，d43～46，靜滴]。化療期間，每周至少接受一次臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。（2）同期放化療：所有患者均采用相同的調(diào)強(qiáng)放射治療（IMRT）技術(shù)，靶區(qū)的劑量建議：PTVnx：68.0～70.4 Gy/30～32 f;PTVnd：64.0～70.4 Gy/30～32 f;PTV1：60.0～64.0 Gy/30～32 f;PTV2：50.0～54.0 Gy/30～32 f。處方劑量為95%的PTV體積所接受的最低吸收劑量;且放療期間均采用順鉑25～30 mg/（m2·周），共6次;在同期放化療結(jié)束后4周進(jìn)行2個療程輔助化療，化療方案同誘導(dǎo)化療。

1.2.2 CTCs檢測方法 采用萊爾生物循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)。應(yīng)用真空采血管采集肘正中靜脈血5 mL置于ACD抗凝管中。采集的血液在48 h內(nèi)去除血漿，裂解液去除紅細(xì)胞，磁珠孵育混勻去除白細(xì)胞，分離液分離富集腫瘤細(xì)胞。使用CD45抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測，8號著絲粒探針進(jìn)行熒光原位雜交。在熒光顯微鏡下計數(shù)，二倍體信號或CD45陽性為正常細(xì)胞，大于等于三倍體且CD45陰性為異常細(xì)胞。根據(jù)試劑盒的說明書，≥2個異常細(xì)胞判斷為循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) 比較治療前后局部晚期鼻咽癌患者CTCs的檢測結(jié)果;比較治療前后CTCs變化與局部晚期鼻咽癌患者療效的關(guān)系;局部晚期鼻咽癌CTCs與患者預(yù)后的相關(guān)性。參考世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的實(shí)體瘤客觀療效評價標(biāo)準(zhǔn)，完全緩解（CR）：所有目標(biāo)病灶消失，或所有非目標(biāo)病灶消失且腫瘤標(biāo)志物水平正常，且至少維持4周;部分緩解（PR）：基線病灶長徑總和縮小≥30%;進(jìn)展（PD）：基線病灶長徑總和增加≥20%，或出現(xiàn)新病灶，或出現(xiàn)新病灶伴有（不伴有）非目標(biāo)病灶;穩(wěn)定（SD）：基線病灶長徑總和有縮小但未達(dá)PR，或有增加但未達(dá)PD。總有效（RR）=CR+PR。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。并運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTCs水平與臨床特征的相關(guān)性 單因素分析結(jié)果顯示，CTCs水平與患者年齡、性別、T分期及M分期均無關(guān)（P>0.05），而與N分期明顯相關(guān)（P<0.05）;Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示，CTCs水平與N分期有相關(guān)性（P<0.05），CTCs陽性患者的N分期更晚。見表1。

2.2 治療前后局部晚期鼻咽癌患者CTCs的檢測結(jié)果比較 治療后3周與治療前的CTCs數(shù)目、陽性情況相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.78，字2=6.23，P<0.05）;治療后3個月與治療前相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.12，字2=5.76，P<0.01），即治療后3周及治療后3個月的CTCs數(shù)目及陽性率均顯著降低。見表2。

2.3 治療前后CTCs變化與局部晚期鼻咽癌患者療效比較 根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評估，治療后3個月CTCs陰性患者的RR顯著高于CTCs陽性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=4.97，P=0.00），見表3。

2.4 局部晚期鼻咽癌CTCs與患者預(yù)后的相關(guān)性分析 根據(jù)Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CTCs陽性患者的總生存時間（overall survival，OS）明顯短于CTCs陰性患者，2年總生存率分別為83.26%和91.23%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.5 治療后CTCs變化與局部轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率比較 治療后隨訪期間，CTCs陰性組轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率均明顯低于CTCs陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3 討論

鼻咽癌作為臨床中發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤，在耳鼻咽喉腫瘤的發(fā)病率中占據(jù)首位[7-8]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查表明，受人們生活習(xí)慣的改變、居住環(huán)境、病毒感染等因素影響，其發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升之勢，引起了臨床上的高度重視。有研究顯示，雖然腫瘤綜合治療與放射治療技術(shù)的發(fā)展已使多種惡性腫瘤的治愈率及5年存活率明顯提高，但局部晚期鼻咽癌患者的5年生存率仍在45%～55%，而治療失敗原因主要是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9-10]?，F(xiàn)階段臨床上預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和預(yù)后風(fēng)險主要依靠綜合腫瘤影像學(xué)資料、病理學(xué)特征等，但這些檢查手段對腫瘤病灶的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無法及時和準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)，患者生存獲益較小[11-12]。因此，尋找鼻咽癌評估患者療效及預(yù)后的新型輔助指標(biāo)就顯得非常重要。

近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)以及分子靶向技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，更多的腫瘤分子標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，為評估治療效果及預(yù)測預(yù)后提供了新的思路和方法[13]。近年來有臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，檢測外周CTCs在鼻咽癌早期診斷、病情發(fā)展監(jiān)測和預(yù)后判斷及療效評估等方面均有重要參考價值[14-15]。CTCs是自發(fā)或因診療操作由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶直接或經(jīng)淋巴系統(tǒng)間接釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而在遠(yuǎn)處組織、器官增殖，是惡性腫瘤患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因[16]。因此，連續(xù)檢測CTCs對局部晚期鼻咽癌患者系統(tǒng)性治療的有效性及預(yù)后評價具有十分重要的臨床意義。文獻(xiàn)[17-18]報道，同步放/化療治療等綜合治療模式是局部晚期鼻咽癌患者的主要治療手段，其療效優(yōu)劣直接關(guān)系到患者的生存質(zhì)量及存活時間，而療效評判的準(zhǔn)確性又影響治療方案的施行，間接影響患者的個體化治療，而CTCs對放化療反應(yīng)敏感，其檢測方法簡單，創(chuàng)傷小，重復(fù)性好，更能真實(shí)地反應(yīng)鼻咽癌患者腫瘤的生物學(xué)特性[19-20]。本研究單因素分析及Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示，CTCs水平與N分期明顯相關(guān)（P<0.05），CTCs陽性患者具有更晚的N分期，且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與治療前相比，治療后3周、3個月CTCs數(shù)目及陽性率均顯著降低（P<0.05），說明CTCs數(shù)目變化可被用來評估對治療的反映，能在治療的早期階段識別病情是否正在被控制，當(dāng)前的治療方式是否對疾病轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生積極作用，有助于臨床醫(yī)師及時改變治療方案，及時更換干預(yù)措施，實(shí)行精準(zhǔn)醫(yī)療，一定程度上提高患者無疾病進(jìn)展期和生存率。且該研究根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評估，發(fā)現(xiàn)治療后3個月CTCs陰性患者的RR顯著高于CTCs陽性患者（P<0.05），提示治療過程中CTCs的變化與療效有關(guān)，能有效及時地評價療效結(jié)果，成為早期評估鼻咽癌病情進(jìn)展的一個有益的補(bǔ)充。本研究生存分析結(jié)果顯示，CTCs陽性患者OS明顯短于CTCs陰性患者（P<0.05），且CTCs陽性患者的淋巴結(jié)分期、局部轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率均明顯高于CTCs陰性患者（P<0.05），這說明CTCs陽性患者的總生存期更短，預(yù)后更差，進(jìn)一步提示連續(xù)監(jiān)測CTCs對患者預(yù)后有一定的預(yù)測作用。

綜上所述，外周血CTCs檢測可用于局部晚期鼻咽癌的療效評價，且對患者具有一定的預(yù)后預(yù)測價值，可能成為鼻咽癌患者早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展及預(yù)后評估的一個輔助指標(biāo)，進(jìn)而為制定個體化診斷和治療提供可靠依據(jù)，值得臨床推薦應(yīng)用。

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（收稿日期：2019-07-31） （本文編輯：程旭然）