乳酸菌計數結果的比較研究

王 杰, 鄭亦舟, 姜 凱, 施凡凡, 袁靜蕓, 王靜彥,趙 渝*, 矯 強

(1.上海師范大學 生命科學學院 植物種質資源開發協同創新中心,上海 200234;2.上海市質量監督檢驗技術研究院,上海 201114; 3.上海師范大學附屬中學,上海 200124;4.貝克曼庫兒特商貿(中國)有限公司,上海 200235)

0 引 言

流式細胞術(FCM)具有檢測速度快,收集數據量大,分析全面,方法靈活等特點,已經成為液體商品生產企業用來進行微生物在線監測、產品質量監控的重要手段[1],也被應用于乳制品、飲料、化妝品、制藥等工業領域[2].相較于傳統的平板計數法[3],FCM所用實驗樣品體積極小,操作方法簡便,檢測結果一致性較好[4].流式細胞儀由液流系統、光學檢測系統、數據存儲及分析系統構成.進行FCM測量時,采用前向和側向兩種方向的散射光進行基本的判定和選擇,前向散射光可以區別細胞大小,側向散射光可以區分細胞內部結構的復雜程度,進而初步區分細胞與其他非生物顆粒,選出目標細胞群落.但對于大小與細胞相差不多的干擾顆粒還需借助熒光染料染色,根據熒光信號進一步區分測試.FCM無需對細胞進行增菌,可直接對單個細胞進行計數,能夠檢測活性細胞的比例以及總菌數,還能對菌種的質量進行評估[5].本文作者以市售發酵乳飲料及發酵乳中的乳酸菌作為研究對象,利用FCM對乳酸菌活菌數進行計數,并將計數結果與平板計數法所得結果進行比對,以期為產品儲藏時間較短,放行壓力較大的乳制品產業提供一種可行的檢測方法和手段.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

本實驗所用發酵乳飲料和發酵乳均為市售產品,6份發酵乳樣品分別編號為R1～R6,10份發酵乳飲料樣品編號為Y1～Y10(為了避免產生影響,此處不列出樣品廠商與型號),重現性實驗中相同濃度的保加利亞乳桿菌懸液分別編號為1～10.

1.1.2 實驗試劑

核酸染色劑(SYTO?24溶液,碘化丙錠PI):Thermofisher 公司;乳酸菌(MRS)肉湯:Thermofisher 公司;MRS瓊脂:Thermofisher 公司;乳酸鏈球菌瓊脂(M17):青島海博生物技術有限公司;MC培養基:青島海博生物技術有限公司;營養肉湯(NB):青島海博生物技術有限公司.

1.1.3 工作液

將100 mg PI溶于1000 mL超純水,得到質量濃度為0.1 mg·mL-1的PI工作液(PI質量分數需控制在0.002%的潛在毒性以下).

將物質的量濃度為5 mmol·L-1的SYTO?24溶液用超純水稀釋,得到物質的量濃度為0.1 mmol·L-1的SYTO?24工作液;

將9 g NaCl晶體,795 mg Na2HPO4·7H2O,144 mg KH2PO4溶于1000 mL超純水中,調節pH值至7.4±0.5,121 ℃下滅菌20 min,得到磷酸緩沖鹽溶液(PBS).

1.1.4 實驗儀器

流式細胞儀(CytoFLEXS):貝克曼庫爾特商貿有限公司;均質拍打器 (JT-10):杭州聚同電子有限公司;生物安全柜 (ZHJH-C1109B):上海智城分析儀器制造有限公司;滅菌鍋(LDZF30KBII):上海申安醫療器械廠;電熱恒溫培養箱 (DHP-9015B):上海一恒科學儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 FCM的重現性

取保加利亞乳桿菌粉溶解于PBS中配制成相同濃度的菌懸液各100 μL,分別加入5 μL PI工作液和5 μL SYTO?24工作液,在37 ℃下孵育3 min后上機(流式細胞儀)檢測,該步驟重復10次,計算變異系數

(1)

其中,S為標準偏差,M為平均數.

1.2.2 樣品前處理

對發酵乳制品樣品(發酵乳飲料或發酵乳)進行稀釋后直接上樣,上樣結果如圖1所示,其中,ASSC為側向散射光強度,AFSC為前向散射光強度,AFITC為綠色熒光通道熒光強度.在散射光通道,發酵乳制品中的干擾比較嚴重,雜質顆粒的側向散射光強度較高,如圖1(a)所示.而在熒光通道,細菌顆粒和雜質顆粒能被很好地區分,這是因為雜質顆粒不具備生物活性,所以無法與熒光染料結合,而細菌顆粒結合了熒光染料之后,會發出特定波長的熒光信號,如圖1(b)所示.因此酵乳制品樣品只需要進行稀釋即可上機檢測.

圖1 發酵乳制品樣品上樣結果

1.2.3 乳酸菌的計數

分別利用FCM、平板計數法對各樣品進行計數,并對比計數結果.

1) FCM.取25 g樣品加入225 mL滅菌PBS緩沖液中,用均質拍打器拍打1～2 min,然后進行梯度稀釋,取100 μL的稀釋液,加入10 μL的PI工作液和10 μL的SYTO?24工作液,再用滅菌PBS緩沖液定容到1 mL,在37 ℃下避光染色和孵育3 min后,上樣讀取120 s.用流式細胞儀圈出SYTO陽性,PI陰性區域作為活菌計數群落,讀取所圈門內的活菌顆粒數,乘以稀釋倍數,即得到樣品中的活菌顆粒數.每個樣品做3次平行實驗,以其平均數作為計數結果.

2) 平板計數法.取25 g樣品加入225 mL滅菌生理鹽水中,按照菌種的添加量適當稀釋后,取1 mL 連續梯度(2～3個)的稀釋液,加入空的平皿中,倒入15 mL MC培養基,在37 ℃下培養72 h,挑取紅色菌落進行計數,此為嗜熱鏈球菌數.再從上述稀釋液中取1 mL,加入空的平皿,倒入MRS培養基15 mL,在37 ℃下培養72 h并計數,此為保加利亞乳桿菌數.乳酸菌的總數為嗜熱鏈球菌菌數和保加利亞乳桿菌菌數之和,每個稀釋度的平皿做2次平行實驗,以其平均數作為計數結果.

2 結果與分析

2.1 流式細胞儀的重現性結果

流式細胞儀的重現性結果如表1所示.

表1 流式細胞儀的重現性結果

由表1可知,在相同的細胞濃度和實驗條件下,活性細菌的變異率為3.46%,非活性細菌的變異率為3.56%,均在5.00%以內,具有較好的重現性.

2.2 發酵乳飲料中FCM與平板計數法活菌計數對比

市售發酵乳飲料中活菌用FCM和平板計數法計數結果如表2所示.

表2 市售發酵乳飲料中活菌用流式細胞法和平板計數法計數結果

注:-表示產品標簽未標注,數據按照國標方法(n=2)計算得出,最終結果為2次平行實驗結果的算術平均,下同

發酵乳飲料中添加的都是活菌FCM和平板計數法檢測結果間存在較顯著的相關性(P=0.9014).

2.3 發酵乳中FCM與平板計數法活菌計數對比

市售發酵乳中活菌用FCM和平板計數法計數結果如表3所示.

表3 市售發酵乳中活菌用FCM和平板計數法計數結果

發酵乳樣品中R4、R6、R8 三個樣品為滅菌型發酵乳,通過平板計數法未檢出菌落,但是用FCM檢出了非活性的菌落群體.而活菌型的發酵乳產品的各組中,兩種方法的檢測結果也呈現明顯的相關性(P=0.9653).

使用FCM和平板計數法對發酵乳制品中的乳酸菌進行計數,比較計數結果,兩者之間呈現明顯的正相關,且流式細胞術的計數結果略高于平板計數法,其主要原因是FCM是對單個細菌顆粒進行計數,而平板計數法是對可培養的細菌形成的菌落進行計數,理論上FCM的計數精確度高于平板計數法.

流式細胞術是非特異性的檢測方法,在食品生產監測中的應用越來越廣泛.在本研究的檢測結果中還包含了除乳酸菌以外的其他細菌的數量,雖然乳酸菌的代謝產物——乳酸會抑制一部分微生物的生長,但是不排除有其他耐酸性微生物生長的情況,如何提高檢測的特異性,如何對不同微生物進行區分,還有待進一步研究.

3 結 論

通過染色劑膜透性的差異將發酵乳及發酵乳制品中的活性乳酸菌和非活性乳酸菌加以區分,再經過FCM的熒光檢測分別得到活性和非活性乳酸菌的數量,達到對發酵乳制品中活菌進行計數的目的.將FCM計數結果與平板計數法結果相比較,結果發現兩者之間有明顯的正相關性,說明流式細胞儀對于細菌活性判定具有準確性,可以作為一種對活性乳酸菌快速計數的有效方法.該方法克服了傳統培養法工作量大,培養時間長,計數結果不穩定且只能計算活菌的缺點,為產品儲藏時間較短,放行壓力較大的乳制品產業提供了一種快速可行的檢測方法.