響應面法優化黑果腺肋花楸多糖提取工藝

◎ 宿華林，王 柳，牟 賀，孫玉葉，魏 登

（吉林農業科技學院，吉林 吉林 132101）

黑果腺肋花楸，也稱不老莓或野櫻莓，是薔薇科腺肋花楸屬植物，原產于北美等地，目前在我國東北地區有大量種植。黑果腺肋花楸果實中的黃酮（鮮果含量高達到0.25%～0.35%）、花青素、多酚是已知植物中含量最高的，多糖的含量也較高。基于此，本文研究黑果腺肋花楸多糖的提取工藝，為黑果腺肋花楸的綜合利用開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

黑果腺肋花楸果實（鮮），購于吉林省安圖縣種植基地。試劑：無水乙醇、乙醚、濃硫酸、葡萄糖、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉以及D-半乳糖等，均購于吉林市物華玻化試劑有限公司。

分光光度計、精密天平、棕色容量瓶、1 mL移液管、吸耳球、小量杯、電子天平、微波消解儀、紫外-可見分光光度計、自動平衡離心機、旋轉蒸發器以及真空干燥機等。

1.2 試驗方法

采用微波輔助法提取黑果腺肋花楸多糖，對料液比、微波功率和提取時間3種因素進行對比分析，確定多糖提取條件，并對黑果腺肋花楸多糖提取工藝進行響應面法優化。稱取黑果（鮮果）100 g，制漿，用蒸餾水溶解漿液，采用微波消解儀輔助法提取；在5 000 r·min-1離心10 min后過濾，再加入蒸餾水二次提取；合并2次提取的上清液，以1∶6的比例用旋轉蒸發器濃縮，至提取液體積最小。加入80%乙醇，靜置（8 h），再次5 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。用石油醚和無水乙醇進行脫脂，真空干燥，制得黑果粗多糖[4]。

1.2.1 單因素試驗設計

對料液比、微波功率和提取時間3個單因素進行試驗，確定提取工藝的最適條件。

1.2.2 響應面優化

以料液比、微波功率和提取時間為自變量，提取量作為響應值，分析三因素與響應值之間的關系，采用響應面軟件中的Box-Behnken方法設計3因素3水平的響應面試驗。

1.2.3 多糖含量的測定

采用苯酚—硫酸比色法，測定黑果多糖含量，其計算公式[5]如式（1）。

人員、經費、就業政策和就業場地等基礎性設施是保障獨立學院就業市場穩定開展的前提條件。然而據調查，安徽省大多數獨立學院專職從事就業工作的人員僅2～3人，人員配備的匱乏制約了對就業市場錯綜復雜事宜的精雕細琢，限制了就業供需市場的維護和開拓；另外，雖然教育部對高校就業經費的支出設定了指標，但是獨立學業受辦學的特點的局限，沒有能力完成這一指標，致使促進就業相關活動的資金存在不足；同時就業政策是就業市場規范化的標桿，多數獨立學院未建立與就業市場相關的制度，再由于教學用地的緊張，獨立學院甚至沒有安排傳統的招聘教室，現代化的視頻面試教室更是無從談起，以上都嚴重的影響了就業市場的現代化進程。

1.2.4 多糖含量的測定

用20 mL蒸餾水溶解10 g黑果腺肋花楸粗多糖，調節pH值為8.5，加入雙氧水使多糖溶液體積分數為40%，用恒溫水浴鍋在40 ℃下加熱4 h，分別用流水和蒸餾水透析8 h，蒸餾水每小時更換1次，得脫色多糖。脫色后的多糖溶液中加入1 g胃蛋白酶，在37 ℃下酶解 4 h后，沸水加熱 10 min，3 000 r·min-1離心10 min，去除變性蛋白質，留上層清液用水,在60 ℃條件下透析2 d，透析后的溶液中加入Sevag試劑（三氯甲烷與正丁醇體積比為4∶1），混合后振蕩20 min，離心5 min，所得上層液為黑果腺肋花楸多糖溶液，重復以上步驟3次。旋轉蒸發去除溶液中的三氯甲烷和正丁醇，加入2倍體積的95%的乙醇溶液進行醇沉，即得脫蛋白后的多糖樣品。用所得黑果腺肋花楸多糖配置料液比為1∶100的多糖溶液，取10 mL多糖溶液至于層析袋中，用層析夾封好，在30 ℃條件下，于500 mL蒸餾水中靜置透析7 h，每2 h更換1次緩沖液，離心，過濾去除沉淀，將剩余清液低溫真空干燥后，得精制多糖。

2 結果與分析

2.1 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸比色法，繪制葡萄糖標準曲線，其回歸方程為Y=7.756x+0.086 35，R2=98.93%

2.2 單因素試驗結果分析

如圖1所示，料液比從1∶7提高到1∶9時，黑果多糖提取量快速上升，隨著料液比的繼續提高，黑果多糖提取量呈緩慢下降趨勢。考慮效價比和成本選擇料液比最佳比例為1∶9。如圖2所示，隨著微波功率提高，在500 W時，提取量最高，繼而呈現下降趨勢，故宜選微波功率500 W。如圖3所示，提取時間呈先升高后下降趨勢，25 min后延長提取時間出現下降趨勢，因此應選擇提取時間25 min，此時黑果多糖的提取率最高。

圖1 料液比對黑果多糖提取量的影響圖

圖2 微波功率對黑果多糖提取量的影響圖

圖3 提取時間對黑果多糖提取量的影響圖

2.3 響應面法優化

2.3.1 響應面試驗設計及回歸方程的確立

以A（料液比）、B（微波功率）和C（提取時間）為自變量，Y（提取量）為響應值，進行響應面回歸擬合分析，見表1～2。

表1 實驗因素和水平表

表2 響應面試驗設計及結果表

從表2響應面試驗結果可知，影響黑果多糖提取的3個因素A、B和C與多糖提取量響應值Y之間的回歸方程為Y=+4.31+0.14A+0.22B+0.052C+0.065AB-0.030AC+0.17BC-0.52A2-0.78B2-0.30C2。

由表3可知，A、B、C三個因素與提取量（Y）之間的相關關系高度顯著，其中A、B、C、A2、B2和C2表現為高度顯著（P＜0.01），AB、AC、BC較顯著（P＜0.05），說明各自變量與因變量之間的關系不是簡單的線性關系，可以預測相應的數值，證明該試驗方案合理；失擬項P值為0.859 4＞0.05，為不顯著，表明誤差較小，擬合度高；從F值來看B＞A＞C，說明提取功率對黑果多糖提取量的影響最大，料液比次之，提取時間影響最小；R2＝0.996 3，R2Adj＝ 0.991 5，R2接近于1，該回歸模型的擬合度效果好。

2.3.3 響應面結果分析

該模型顯示微波功率對黑果多糖提取量的影響最大，料液比次之，提取時間最小，AB、BC之間具有明顯的交互作用，且P值均小于0.05，AC交互作用不明顯，P值大于0.05。

2.3.4 驗證實驗

試驗結果表明，微波輔助法提取黑果多糖的最佳工藝為：料液比1∶9.651（g·mL-1）、微波功率509.04 W、微波提取時間25.16 min，提取量為4.46%，綜合考慮實驗操作的可行性以及生產的實際成本，將結果修正為：料液比1∶10（g·mL-1）、微波功率500 W、微波時間25 min，并進行三次以上實驗驗證，實際測得黑果腺肋花楸多糖含量為（4.46±0.02）%，與預測值基本相符。

2.4 多糖純化

按照1.2.3黑果多糖含量的測定方法，得脫蛋白后的多糖樣品，用所得黑果腺肋花楸多糖配置料液比為1∶100的多糖溶液，取10 mL多糖溶液至于層析袋中，用層析夾封好，在30 ℃條件下，于500 mL蒸餾水中靜置透析7 h，每2 h更換1次緩沖液，離心，過濾去除沉淀，將剩余清液低溫真空干燥后，得精制多糖7.32 g

3 結論

采用微波輔助法提取黑果多糖，以A（料液比）、B（微波功率）和C（提取時間）為單因素，用響應面法對黑果腺肋花楸多糖提取工藝進行優化，結果表明微波輔助法提取黑果花楸多糖的最佳工藝條件為：料液比1∶9.651（g·mL-1）、微波功率509.04 W、提取時間25.16 min，提取量預測為4.45%。綜合考慮實驗操作的可行性以及生產的實際成本，將結果修正為：料液比1∶10（g·mL-1）、微波功率500 W、微波時間25 min，并進行3次以上實驗驗證，實際測得黑果腺肋花楸多糖含量為（4.46±0.02）%。