飽和臭氧水對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的降解研究

譚 琳，杜華英，吳國平，湯凱潔

(江西農業大學食品科學與工程學院，江西南昌330045)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名嘔吐毒素(vomitoxin)。屬B型單端孢霉烯族毒素，主要是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌等真菌產生的次級代謝產物。DON常污染于糧谷作物中，食用含此毒素的食品或飼料，通常會對人或動物產生毒害作用，表現為嘔吐、腹瀉、惡心等癥狀，嚴重者可能導致組織病變或死亡[1]。因此我國國家標準2017年規定食品中DON的限量標準為1 mg/kg[2]。糧谷類作物在生產、貯存、加工等環節，由于氣候和環境因素的影響，尤其是高熱高濕的條件下更容易產生此毒素[3]。因此研究合理的措施降解食品或者飼料中的DON含量具有重要的意義。目前見文獻報道DON的降解處理方法有物理方法和化學方法。如169～243 ℃下油煎加熱處理可以降解21%～28%的DON[4]，200 ℃處理玉米樣品15～20 min，DON可以降解11.58%～15.26%[5]；1 kg玉米加300 mL水和50 g亞硫酸鈉，121 ℃加熱1 h后DON降解87%[6-7]，Trenholm等[7]研究被DON污染的小麥經0.1 mol/L碳酸鈉浸泡24～72 h后DON降解42%～100%，效果良好[8]；物理降解DON需高熱和加壓設備，成本較高；化學降解DON效果好，但可能有化學試劑的殘留，引入新的不安全因素。目前新興的生物降解處理研究也有很多報道[9-13]。但安全有效的物理降解措施一直成為研究的熱點，國內外學者利用臭氧或紫外燈就農作物中污染的真菌毒素做過很多研究，如降解黃曲霉毒素[14-17]，而對DON的降解研究還較少。考慮到臭氧處理完樣品后，在常溫常壓下它可以很快分解成氧氣，因此幾乎沒有有害物質殘留，也不會造成人身損害，1997年美國食品藥品監督管理局已經批準臭氧可作為食品安全物質直接加入食品中[18]。另外有學者研究過臭氧降解DON后的面粉品質及產物毒性較低[19-21]，因此使用臭氧降解后的安全性較高。本文研究了臭氧水降解DON標準品和面粉加標中DON的效果，為評價臭氧水降解飼料或者糧谷類污染DON的應用提供了一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DON標準品，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，美國格雷斯公司；鹽酸、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、硫酸均為分析純，天津市永大化學試劑有限公司；碘化鉀(分析純)，上海銀典化工有限公司；面粉、小麥、玉米等樣品，購于超市；SupelTMTox DON SPE凈化柱(55316-U型)，美國西格瑪公司；超純水由Milli-Q純水儀制備，法國密理博公司。

1.2 儀器與設備

Waters E2695高效液相色譜儀(美國Waters 公司，配DAD檢測器，四元泵)；C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5.0 μm)，Waters公司；PHS-TPB型酸度計(上海大普儀器有限公司)；XM-T5型欣美臭氧發生器(青島欣美凈化設備有限公司)；HC-2518R型高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；QT-2型旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；WD-12氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑的配制和樣品的處理 DON標準液的制備：稱取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品1 mg，用流動相乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)1 mL溶解，旋渦震蕩30 s，制成1 000 μg/mL的DON標準貯備液，放置4 ℃冰箱存儲備用。不同pH的超純水制備：將超純水用0.10 mol/L HCl、0.01 mol/L HCl、0.10 mol/L NaOH和0.01 mol/L NaOH調節pH分別為：4.00、4.50、5.00、5.50、6.00和6.50，臨用時制備。臭氧水制備：實驗所用臭氧水是采用高純氧氣通過臭氧發生器所得到的臭氧氣體直接通入水中制得。樣品制備：顆粒樣品經粉碎機粉碎后過40目篩后取粉末備用。

1.3.2 高效液相色譜流動相的優化 高效液相色譜條件：進樣量20 μL、柱溫30 ℃、紫外檢測波長220 nm，流動相流速1 mL/min。

1.3.3 標準曲線的制作 取20 μL濃度為0.01，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 μg/mL的DON標準工作液，按HPLC流動相優化了的條件進行檢測，得到不同濃度DON標準品的峰面積，根據峰面積和標準液濃度建立關系曲線，計算R2和回歸方程。

1.3.4 臭氧水穩定性的研究 在通風櫥內臭氧氣體流量控制為0.5 L/min(所有實驗均為此流量)，穩定后自導管通入含水的燒杯中，通過調節臭氧發生器的時間對不同pH和溫度的水進行優化，經碘量法[19]測定后得到臭氧含量高的臭氧水。

(1)充臭氧時間對臭氧含量的影響。選擇pH為6.50的超純水50 mL，室溫條件下通入超純水的臭氧時間控制為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 min，通完氣體后立即用碘量法檢測水中臭氧的含量，以確定臭氧含量達到飽和時充臭氧的最佳時間。

(2)不同pH對臭氧含量的影響。考慮不同酸度對臭氧穩定性的影響，選取pH值為4.00、4.50、5.00、5.50、6.00和6.50的超純水50 mL，水溫35 ℃充入臭氧時間為5 min，對比不同pH值條件下臭氧水中臭氧的含量。

(3)不同溫度對臭氧含量的影響。取pH 4.00的超純水50 mL，充入臭氧時間均控制為5 min，對比不同溫度條件下：0，10，20，30，35，40，45，50，55 ℃水中臭氧的含量，確定臭氧較高含量的溫度。

1.3.5 臭氧水對DON標準品的降解研究 取50 μg/mL的DON標準品20、40、100、200 μL加入干凈的進樣瓶中并60 ℃烘干，冷卻至室溫后用0 ℃超純水配制的飽和臭氧水1 mL立即加入各進樣瓶中，10 min后立即60 ℃加熱5 min以分解掉水中剩余的臭氧，然后旋渦震蕩30 s進行高效液相色譜檢測，另做5組平行實驗。得到臭氧水對不同含量DON標準品的降解率。

1.3.6 臭氧水降解面粉DON的應用研究 (1)面粉樣品處理。DON面粉加標制備：稱取2.000 g新鮮面粉(未檢出DON)于干凈的10 mL塑料離心管中，然后加入100 μg/mL的DON標準品100 μL自然風干后混勻。

臭氧水降解加標面粉 ∶ 選取面粉 ∶ 水的質量比1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6、1 ∶ 7和1 ∶ 8進行試驗，用所制得的臭氧水立即按上述比例加入1 g加標的面粉中并不斷手動震蕩混勻，潤濕后靜置10 min，再40 ℃鼓風干燥烘干待用。

(2)面粉樣品中DON的提取。取1.000 g上述干燥的面粉樣品置于10 mL塑料離心管中，加入3 mL乙腈-水(84 ∶ 16,V/V)，超聲提取5 min后于10 000 r/min離心10 min后取上清液，重復提取3次，收集上清液在60 ℃條件下氮吹干后用1 mL乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)復溶，旋渦震蕩30 s，復溶液經過0.22 μm濾頭轉入液相自動進樣瓶中4 ℃冰箱保存備用。

(3)面粉樣品凈化。取(2)制備樣液加入SupelTMTox DON SPE凈化柱(55316-U型)中，然后加入2 mL乙腈-水(84 ∶ 16,V/V)分2次(2 mL × 2)過柱，所得濾液用10 mL離心塑料管收集，60 ℃氮吹干，所得殘留物用1 mL乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)復溶，旋渦震蕩30 s，復溶液經過0.22 μm濾頭轉入液相自動進樣瓶中進行高效液相色譜分析。

(4)臭氧水對飼料樣品中DON降解效果研究。取0 ℃超純水配制的飽和臭氧水按樣品：水的質量(1 ∶ 5)加入小麥、玉米、面粉樣品中靜置10 min，重復上面臭氧水對面粉樣品的提取和凈化操作，研究臭氧水對不同樣品中DON的降解效果。

1.3.7 降解率計算 臭氧水處理DON降解率計算公式：

(1)

式中：C(t)為樣品中DON經臭氧水處理t時間后的濃度；C(0)為樣品中DON的初始濃度。

1.3.8 數據處理與統計分析 實驗重復至少3次，HPLC測定中采用empower軟件進行數據采集，數據采用Excel、IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜流動相的優化

目前見文獻[22-23]和國標報道[24]的高效液相色譜法測定DON方法中流動相有甲醇-水和乙腈-水，本試驗設計了甲醇-水(2 ∶ 8,V/V)，甲醇-水(1 ∶ 9,V/V)，乙腈-水(2 ∶ 8,V/V)，乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)4種流動相對DON色譜峰的出峰時間和峰型的影響。4種流動相的高效液相色譜圖見圖1。

[a.乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)；b.甲醇-水(2 ∶ 8,V/V)；c.甲醇-水(1 ∶ 9,V/V)；d.乙腈-水(2 ∶ 8,V/V)][a.acetonitrile-water(1 ∶ 9,V/V)；b.methanol-water(2 ∶ 8,V/V)；c.methanol-water(1 ∶ 9,V/V)；d.acetonitrile-water(2 ∶ 8,V/V)]圖1 4種不同流動相高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograph of different four mobile phase

由圖1可以看出，乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)的峰形和乙腈-水(2 ∶ 8,V/V)的峰形都漂亮，但乙腈-水(2 ∶ 8,V/V)的出峰時間太早(tR為4.37 min)，在后續加標實際樣品檢測中容易與雜質峰出峰時間重疊，影響DON的定性和定量分析；而甲醇-水(1 ∶ 9,V/V)和甲醇-水(2 ∶ 8,V/V)的峰型都欠佳，甲醇-水(1 ∶ 9,V/V)的峰型明顯展寬，影響檢測限和靈敏度；甲醇-水(2 ∶ 8,V/V)的峰型對稱性較差，并且有“拖尾”現象。因此，后面的實驗都采用乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)為流動相。

2.2 DON標準曲線

圖2 DON標準曲線Fig.2 Calibration curve of deoxynivalenol

DON標準品濃度與峰面積的關系曲線如圖2所示。

圖2可知，DON標準液在0.01～10 μg/mL內線性關系良好，回歸方程為y=19 274x-236.41，相關系數R2=0.999 9，該方法可以滿足DON的痕量檢測。

2.3 臭氧水穩定性的實驗

有報道臭氧水對真菌毒素具有一定的降解效果[25-26]，因此研究臭氧在水中的穩定性可以更好地控制DON的降解條件。臭氧在水中的含量和穩定性主要受充臭氧時間、水的pH和溫度等條件的影響，試驗結果如圖3所示。

由圖3(a)可以看出充臭氧時間在0～1 min內臭氧的含量迅速上升，在5 min左右趨近飽和，達到21.8 mg/L，5 min以后臭氧的含量變化不明顯，因此后面的實驗選擇充臭氧時間為5 min。方敏等[26]研究報道臭氧在pH為4以下的酸性水中穩定性不高，在堿性條件下臭氧分解又會加劇，因此本試驗選擇水的pH范圍為4.00～6.50進行研究，由圖3(b)pH的影響可以看出，當pH從4.00逐漸升高至6.50，臭氧含量從31.0 mg/L下降至21.8 mg/L，說明臭氧在較高pH值穩定性差。圖3(c)顯示臭氧水在0～60 ℃內，溫度越低臭氧的穩定性越好，在50 mL的超純水中充入臭氧5 min后0 ℃時溶解量最大達到73.2 mg/L。因此，從圖3(a)、3(b)和3(c)可以看出，溫度為0 ℃，pH值為4.00，充臭氧時間為5 min后，臭氧在水中的溶解度達到飽和值73.2 mg/L。

2.4 臭氧水對DON標準品的降解研究

(a.充臭氧時間對臭氧在水中溶解的影響；b.pH對臭氧在水中溶解度的影響；c.溫度對臭氧在水中溶解度的影響)(a.Effect of time on the dissolution of ozone in water；b.Effect of pH on the dissolution of ozone in water；c.Effect of temperature on the dissolution of ozone in water)圖3 時間、pH和溫度對臭氧在水中溶解度的影響Fig.3 The effect of ozone solubility in water on different time,pH and temperature

影響臭氧水對DON降解效率的主要因素有降解時間和臭氧水與DON的最佳比例。根據Sun等[27]研究報道，飽和臭氧水處理DON標準品7 min降解率達到最大。因此，本實驗采用降解時間為10 min后測定其降解率，然后進一步優化臭氧水和DON的最佳比例。

圖4為1 mL飽和臭氧水處理1 μg、2 μg、5μg和10 μg的DON標準品的降解率，由圖4可以看出，低濃度的DON降解率較高，隨著DON含量的增加其降解率下降，1 μg DON經過臭氧水處理后降解率達99.6%，2 μg的DON降解率為99.4%，5 μg的 DON降解率為99.0%，可以認為DON接近被完全降解；而當DON含量繼續增加到10 μg時，降解率為98.5%。由此可以看出當固定臭氧水的量一定時，隨著DON含量的增加，DON的降解率緩慢地下降，造成這種趨勢可能的原因是臭氧水與DON比例的變化導致的，因此，后面的面粉樣品的降解采用臭氧水：DON為1 mL 73.2 mg/L，5 μg。

圖4 0 ℃飽和臭氧水對不同含量DON標準品的降解Fig.4 0 ℃ saturated ozone water on the degradation of different content of standard DON

圖5是DON經臭氧水降解后和降解前的高效液相色譜圖。由圖5(a)可以看出，經過臭氧處理后，DON含量明顯下降，且在DON色譜峰的左右各出現一個新的色譜峰x和y，這兩個峰可能是DON的降解產物。由于臭氧降解DON的產物量非常少，難于收集到，因此，目前還未見報道該降解產物的具體結構，僅有根據相關軟件模擬推測的結構。據王莉等[28]報道，臭氧對DON的降解，作用方式符合Criegee機制，即DON中的C9-C10雙鍵會被臭氧打開，形成加成反應，加入了3個氧原子，最終分解成含有醛酮基團的羰基化合物。另外Sun等[27]采用Q-TOF MS也檢測到DON的兩種降解產物，并推測其結構和理化性質非常接近DON。從本實驗圖5兩種未知物x和y的出峰時間也可以看出，這兩種降解產物的極性與DON非常接近，這與Sun等[27]的推測一致。

2.5 臭氧水降解加標面粉中DON的應用研究

在使用臭氧水進行降解加標面粉試驗前，對5.0 mg/kg的加標面粉經SupelTMTox DON SPE凈化柱凈化前后進行分析，計算DON的回收率。加標面粉凈化前后的高效液相色譜圖如圖6所示。

a.DON降解后的高效液相色譜圖；b.飽和臭氧水高效液相色譜圖；c.DON標準品高效液相色譜圖a.chromatograms of DON degradation products；b.ozone water at pH 4.00；c.chromatograms of DON standard圖5 DON及DON降解產物色譜圖Fig.5 Chromatograms of DON and DON degradation products

a.面粉加標5.0 mg/kg未凈化色譜圖;b.面粉加標5 mg/kg凈化后色譜圖a.chromatogram of spiked 5.0 mg/kg DON in flour with SupelTMTox SPE purification;b.chromatogram of spiked 5.0 mg/kg DON in flour without SupelTMTox SPE purification圖6 加標面粉經SupelTMTox DON SPE凈化柱前后色譜圖Fig.6 Chromatogram of spiked flour with SupelTMTox SPE purification and without,respectively

圖7 不同飽和臭氧水比例對加標面粉中DON的降解率(n=6)Fig.7 DON degradation rate of different ratio of saturated ozone water with flour (n=6)

由圖6經SupelTMTox DON SPE凈化柱處理前后的液相色譜圖可以看出，該柱凈化效果很好，可以明顯去除多種雜質，經標準曲線回歸方程計算，加標面粉的回收率在(97.2±1.7)%，能較好的滿足檢測需要。

臭氧降解小麥中的DON，高濕度可以提高降解率[21,25]，考慮面粉具有很強的吸水性，本實驗設置8個不同飽和臭氧水與加標面粉的比例進行降解試驗，結果見圖7。

由圖7可以看出，隨著飽和臭氧水的增加，加標面粉中的DON降解率增大。當飽和臭氧水：面粉的質量比為5 ∶ 1時，降解率最大，為82.6%，繼續增加水的含量，降解率幾乎沒有變化。

采用臭氧水5倍于樣品質量的比例對面粉加標濃度分別為0.500、1.000、5.000 mg/kg面粉進行處理，經臭氧水處理前后的降解率如表1所示。

表1 飽和臭氧水對不同加標面粉中DON降解率和精密度(n=6)

從表1可以看出，面粉中不同加標濃度DON的降解率在82.53%～84.81%，RSD在0.61%～1.23%，可以看出臭氧水降解面粉樣品中的DON具有預期的效果。本實驗中加標面粉中的DON(5.00 mg/kg)的降解率較余以剛等[19]報道的面粉中加標DON(4.95 mg/kg)的降解率高出一倍以上。

2.6 臭氧水處理陽性飼料級和食用級樣品中DON的應用研究

DON在飼料中的污染很普遍，也很嚴重，根據江蘇奧邁生物科技有限公司分析中心對新上市的玉米中霉菌毒素報告，嘔吐毒素的污染率為100%，檢測量在300～400 μg/kg。本實驗室也檢測了市場上購買到的30個樣品，其中6個為飼料級的小麥樣品，檢出率為100%，檢測量在3.91～6.92 mg/kg；食用級玉米和面粉樣品各12個，其中有兩個玉米和兩個面粉樣品未檢出，檢出率為83.3%，檢測量在0.09～1.76 mg/kg。然后分別選擇了6個小麥、玉米和面粉陽性樣品進行降解試驗，降解結果如表2。

表2 臭氧水對市售飼料樣品中DON的降解率(n=6)

從表2可以看出，飽和臭氧水對陽性小麥、玉米和面粉樣品中的DON進行處理后，樣品中的DON均得到有效降解，降解率在82.46%～83.70%，RSD在0.89%～1.89%。由表2可以看出，陽性樣品經臭氧處理后的DON檢測值均低于1 mg/kg，符合國家標準。

3 結論與討論

臭氧具有很強的氧化性，能氧化DON，使其毒性下降[28-29]。但臭氧在常溫常壓下穩定性較差，可自行分解為氧氣。因此，研究制備飽和臭氧水的條件可以使DON降解率達到最大。飽和臭氧水受充臭氧時間、pH和溫度的影響，在pH為4.0、溫度0 ℃、體積為50 mL的超純水中充入臭氧(流量0.5 L/min)5 min后可達到飽和，經碘量法測定，臭氧含量為73.2 mg/L。采用該飽和臭氧水對5 μg的DON標準品降解率可達99.0%，經高效液相色譜法檢測到兩個降解產物色譜峰x和y，產物的結構鑒定需要進一步的實驗確定。對加標DON濃度為5 μg/g面粉降解時，當添加飽和臭氧水的量為面粉質量的5倍時，DON的降解率最高，為82.6%。據李煥[30]的報道，直接采用臭氧處理小麥麩皮易產生正已醛、壬醛等不良風味的揮發性物質，且持續時間長，而采用飽和臭氧水處理不僅無不良風味，還改善了面筋網絡，提高了面筋品質。本試驗采用飽和臭氧水對小麥、玉米和面粉不同陽性樣品進行了降解研究，DON的降解率在82.46%～83.70%，降解后的DON均低于國家限量標準[2]，但該降解率不及臭氧水對DON標準品的降解率，推測可能的原因是樣品中的面粉介質對臭氧的滲透有一定干擾作用。另據邵慧麗[29]和孫超[31]研究顯示，臭氧處理可提高小麥粉的白度，而對其蛋白質、淀粉和脂肪酸等營養成分的影響不顯著。因此采用臭氧水在谷類樣品的使用安全性較高，結合本研究可以看出飽和臭氧水對DON的降解具有一定的應用潛力。