獼猴桃幾丁質酶基因克隆及生物信息學分析

賀 哲，王園秀，張圣潔，蔣軍喜*

(1.江西農業大學農學院，江西南昌330045；2.江西農業大學生物科學與工程學院，江西南昌330045)

獼猴桃泛指獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)植物，其果實營養豐富、風味獨特，是我國近年大力發展的新興水果之一。江西省奉新縣是我國獼猴桃主產地之一，其優越的自然資源和生態環境非常適合獼猴桃種植，但同時獼猴桃果實熟腐病(簡稱果腐病)等病害問題也十分突出[1-2]。果腐病是一種由子囊菌門葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的真菌病害，鑒于真菌的細胞壁主要成分為幾丁質，發揮幾丁質酶降解幾丁質的作用無疑是防治植物真菌病害的一條有效途徑[1,3-6]。近年來，筆者篩選到對果腐病具有顯著抗性的‘金艷’等獼猴桃品種[2]，并通過轉錄組測序發現幾丁質酶基因在接菌的‘金艷’果實中呈現上調表達，此結果表明幾丁質酶基因很可能在‘金艷’抗果腐病中發揮了作用。為此，按前期獲得的轉錄本序列設計引物，從‘金艷’中克隆幾丁質酶基因并進行生物信息學分析，以期為深入研究其抗病功能和轉基因利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

江西省奉新縣山口獼猴桃園中處于近成熟期的‘金艷’獼猴桃果實；葡萄座腔菌菌株BDF-6保存于江西農業大學植物病理研究室，接種前在PDA平板上活化培養。

1.2 接種方法

將培養菌落外圍菌絲體打成直徑5 mm的菌餅，采用刺傷法將菌餅接種到‘金艷’近成熟果實上，共接種20個果實。接種后72 h從病斑病健交界處對發病果肉進行取樣，樣品快速取下后立即用液氮速凍并速帶回實驗室于-70 ℃保存備用。

1.3 獼猴桃總RNA的提取

使用RNA提取試劑盒(上海普洛麥格)，按其操作說明提取樣品總RNA。

1.4 幾丁質酶基因的RT-PCR擴增

以提取的RNA為模板，使用反轉錄試劑盒(美國Promega)按其說明對獼猴桃幾丁質酶基因進行RT-PCR擴增，擴增的引物按照前期獲得的獼猴桃轉錄組數據自行設計，上游引物AcC-F：5′-ATGAGGGTTTGGCTACTAGC-3′，下游引物AcC-R：5′-CTATGCAAAAGGCCTCTGGT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成，擴增片段長度預期795 bp。PCR擴增反應體系為50 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板4 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，無核酸酶水17 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃補平10 min。PCR擴增產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 克隆、測序及序列分析

回收目的片段，使用pEASY-T3 Cloning Kit試劑盒(北京全式金)按其說明進行克隆，將含有目的片段的陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司進行測序。使用Lasergene 7.0 軟件進行序列拼接，使用NCBI 中BLAST程序對拼接好的序列進行在線比對。

1.6 序列編碼產物生物信息學分析

進入表1所列網址對獼猴桃幾丁質酶基因編碼產物進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃總RNA提取

對接種果腐病菌72 h后的金艷獼猴桃果實進行RNA提取，電泳結果(圖1)顯示28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，表明提取的總RNA較完整；條帶明亮，表明總RNA濃度較高，符合實驗要求。

表1 本研究中生物信息學分析網址匯總

2.2 幾丁質酶基因的RT-PCR擴增

以提取的總RNA為模板，反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板，進行獼猴桃幾丁質酶基因完整編碼區的PCR擴增，結果擴增到一條長度約為795 bp的片段(圖2)，片段長度與預期相符。

M:DL 2 000 marker;1:目的條帶M:DL 2 000 Marker;1:Target product圖1 ‘金艷’獼猴桃果實總RNA凝膠電泳結果Fig.1 Agrose gel electrophoresis of total RNA in ‘Jin Yan’ kiwifruit

M：DL 2 000 Marker；CK：陰性對照；1：目的片段M:DL 2 000 Marker;CK:Negative control;1:Target product圖2 獼猴桃幾丁質酶基因RT-PCR擴增產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis of RT-PCR product of chitinase gene of kiwifruit

2.3 幾丁質酶基因克隆、測序及序列分析

對PCR產物進行回收、克隆和序列測定，獲得其核苷酸序列長度為795 bp(在GenBank中登錄號MH580296)，編碼264個氨基酸，將克隆的此基因命名為AcCHI1。經Blast比對發現AcCHI1氨基酸序列與GenBank中的山茶(Camelliasinensis)幾丁質酶基因(GenBank登錄號KR078345.1)氨基酸序列同源性最高，為81%。

2.4 獼猴桃幾丁質酶蛋白生物信息學分析

2.4.1 蛋白結構特征分析 根據NCBI蛋白保守結構域預測，AcCHI1隸屬于Chitinase_glyco_hydro_19 domain-containing protein(圖3)，即屬于19家族幾丁質酶，而按氨基酸序列特征被描述為Chitinase class I，屬于I 類幾丁質酶。

圖3 AcCHI1蛋白保守結構域預測Fig.3 Conserved domains forecast for protein of AcCHI1

2.4.2 蛋白理化性質分析 AcCHI1的分子式為C1288H1935N351O371S11，總原子數3 956，分子質量28.6 ku，等電點 8.58。在氨基酸組成上，最多的氨基酸為Gly (G)，共32個，占12.1%，最少的氨基酸為His (H)和Met (M)，各3個，占1.1%。酸性氨基酸(Asp+Glu) 19個，堿性氨基酸(Arg + Lys ) 23個；脂肪族氨基酸指數為69.58，不穩定指數為29.48，推測為穩定蛋白。

圖4 AcCHI1疏水區/親水區預測Fig.4 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic regions of AcCHI1

2.4.3 蛋白親疏水性預測 蛋白質的親水/疏水性特征是蛋白質折疊的基礎。利用在線分析軟件ProtScale對AcCHI1進行親水/疏水性分析(圖4)，根據蛋白質親水和疏水的得分判定(即得分<-0.5的區域為親水區，得分>0.5的區域為疏水區，得分在+0.5～-0.5的為兩性區)，AcCHI1含有13個疏水區，21個親水區，因此可以認為該蛋白在總體上為親水性蛋白。

2.4.4 跨膜結構預測 利用TMHMM軟件分析預測AcCHI1的跨膜結構(圖5)，圖中紅線代表跨膜，紫線代表膜外，藍線代表膜內，根據最上端紫色粗線條顯示，全部氨基酸位于膜外，因此，AcCHI1不具有跨膜結構，不屬于膜蛋白。

圖5 AcCHI1跨膜結構分析Fig.5 Transmembrane structure analysis of AcCHI1

2.4.5 信號肽分析 利用軟件SignalP-4.1對AcCHI1有無信號肽進行預測(圖6)，其中C-Score為剪切位點值；S-Score為信號肽區域值；Y-Score為剪切位點校準值。由圖6可知該蛋白的S值區間為1～19個氨基酸之間，C值最大值在第20個氨基酸，Y值最大值在第20個氨基酸。因此推斷AcCHI1含有信號肽，信號肽區域為1～19個氨基酸，信號肽剪切位點位于第20個氨基酸。

2.4.6 二級結構分析 圖7為利用GOR4預測的AcCHI1的二級結構，其中組成α螺旋(Alpha helix)的氨基酸共48個，占18.18%，包含在無規則卷曲(random coil)中的氨基酸共149個，占56.44%，組成延伸鏈(extended strand)的氨基酸共67個，占25.38%。

圖6 AcCHI1信號肽的預測和分析Fig 6. Prediction and analysis of signal peptide of AcCHI1

藍色線：α螺旋；紅色線：延伸鏈；紫色線：無規則卷曲Blue line:Alpha helix;Red line:Extended strand;Purple line:Random coil圖7 AcCHI1的二級結構預測Fig.7 Secondary structure prediction of AcCHI1

圖8 AcCHI1的三級結構預測Fig.8 Tertiary structure prediction of AcCHI1

2.4.7 三級結構分析 三級結構是指經過充分折疊，能發揮生物活性、可以執行特定生物催化功能的完整三維立體結構。在對AcCHI1進行三維結構同源建模時，以I類幾丁質酶(4tx7.1.A)作為同源目標模板，利用Swiss-Model軟件進行分析，發現AcCHI1與同源模板結構的相似度為69.67%，圖8為利用同源建模生成的AcCHI1的三維立體結構。

3 討論

本研究首次從獼猴桃中克隆到幾丁質酶基因AcCHI1(GenBank登錄號MH580296)，并利用生物信息學方法對AcCHI1蛋白的分子特征進行了分析和預測。結果表明AcCHI1屬于19家族成員，同時屬于I類幾丁質酶。目前，有關幾丁質酶的分類方式主要有2種，一是根據幾丁質酶催化區氨基酸序列同源性，將幾丁質酶分為2個家族，即18家族和19家族。其中18家族幾丁質酶來源于細菌、真菌、病毒及一些植物；19家族主要由植物幾丁質酶構成，同時在一些放線菌中也有發現[6-9]。二是根據氨基酸序列特征，將幾丁質酶分成6類，即ClassⅠ～Ⅵ,其中的Ⅰ類幾丁質酶因含有結合幾丁質的結構域，增強了酶對底物的親和力，而具有強烈的抗真菌活性[10-12]?？梢钥闯?，本文將AcCHI1基因歸在19族與19族幾丁質酶主要來自植物的結論是一致的，同時也表明AcCHI1基因很可能具有寶貴的應用價值。

植物中并無幾丁質，但幾丁質酶普遍存在于植物中，顯然幾丁質酶很可能參與植物防衛反應特別是參與植物對真菌病害的抗性反應[13]，由此也引發了大量有關植物幾丁質酶基因克隆、產物特性及應用研究。目前，已從水稻、棉花、煙草、甘蔗、梨、菜豆、馬鈴薯、茶樹、菊花等100余種植物中克隆到幾丁質酶基因[14-19]，并且在水稻、花生、黃瓜等多種植物中開展了轉幾丁質酶基因研究，結果顯示轉基因植株不同程度增強了對一些真菌病害的抗病能力[14,20-21]。奉新縣大部分獼猴桃品種不抗果腐病，特別是‘紅陽’、‘金果’等優良品種果腐病發生嚴重[2]，獼猴桃幾丁質酶基因的獲得將為從遺傳上改良這些品種以增強其對果腐病抗性帶來了希望。