越冬條件對豚草種子內生真菌壽命和種子發芽能力的影響

王國紅，李紹鋒，楊民和，張斯琴，張碧堯

(福建師范大學生命科學學院/細胞逆境響應與代謝調控福建省高等學校重點實驗室，福建福州350108)

豚草(AmbrosiaartemisiifoliaL.)是起源于北美的一年生菊科植物，種子是唯一的繁殖體，也是擴散的唯一途徑。近200年來，豚草迅速在世界各地蔓延，在美洲、歐洲、亞洲和澳洲等地區均有分布[1-2]。豚草具有廣泛的生態適應性和很強的競爭能力，是一種嚴重危害農業、生態和人體健康的惡性雜草。豚草自20世紀30年代侵入中國，發生范圍迅速擴張，目前在我國21個省、市和自治區廣泛分布[3]。在福建省，豚草于1993年首次在長樂市被報道[4]。

針對生物入侵的機制，學術界陸續提出了一些假說，其中比較重要的有天敵逃避假說[5]、入侵種的引入后進化假說[6]、促進的共生假說[7]等。豚草種子特性，如種子數量大、發芽的生態可塑性、種子初次休眠和再次休眠以及土壤種子庫是決定其生態適應性的關鍵因素[8-9]。同時，豚草的生態可塑性很強，其種子發芽和休眠特性隨分布緯度的不同而變化，分化出適應當地環境條件的生理種群[1-2]。進入新的地域后，入侵植物與生物的相互作用是影響種群建立和擴散的另一個關鍵因素[7,10]。真菌是土壤中和植物體的常見寄居者，可作為病原菌導致種子、芽和幼苗的腐爛[11],或作為益生菌促進種子生活力和生長[12]，從而影響植物的生態適應性和競爭力[13]。豚草種子成熟后落入土壤，不可避免地要和土壤生物(包括真菌)發生關系[14]。內生真菌是一類生活于健康植物體內，對植物沒有引起病害癥狀的微生物。豚草種子中生長有豐富的內生真菌，一些真菌的發酵液對豚草種子發芽和幼苗生長有不同的生物學作用[15]。

中國的福建省長樂市冬季氣候溫暖濕潤，與豚草的北美原產地差異明顯[4]。豚草擴張進入福建省沿海地帶后，溫暖濕潤的冬季環境，以及不同的越冬條件可能對豚草種子休眠、發芽和種帶內生真菌等產生影響。本研究通過分析豚草種子越冬和儲存期間種子內生真菌的存活能力和種子發芽能力的動態變化；土壤種子和植冠種子內生真菌感染和種子發芽的動態變化；以及實驗條件下土壤種子的發芽動態，旨在考察溫暖冬季和不同越冬條件對豚草種子內生真菌存活與種子發芽能力的影響，探討越冬條件、種子內生真菌和豚草種子發芽之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究地域概況

研究區域位于中國福建省長樂市松下鎮寨下村(25°46′32″N,119°37′14″E)，屬于中國東部沿海，是中亞熱帶和南亞熱帶的過渡區；氣候類型為亞熱帶海洋性季風氣候，溫暖濕潤，四季分明；年平均溫度在15.6～19.3 ℃，積溫為6 375.6 ℃，一般7月氣溫最高(平均溫度25～34 ℃)，1月最低(平均溫度8～15 ℃)；雨量充沛，年平均降水153 d,平均降雨量為1 200～1 700 mm，降雨多在3—9月，4—6月為梅雨季節；無霜天數333 d；光照充足，年均日照時數為1 837.6 h，且光照、溫度和降水配合良好，雨熱同季。土壤為海灘沙土。8—10月臺風發生較為頻繁，秋、冬季節以東北風為主；風卷沙土，有利于豚草種子的短距離擴散。

1.2 種子采集

選擇人為活動較少、接近自然狀態的區域為采樣點，參照李紹鋒等[15]的方法取樣。采集植冠種子時，每一采樣點隨機選取5植株，每一植株采集3個分枝上的種子，將每一樣點共25植株種子混合，用透氣袋裝好，存放在陰涼處備用；每年12月以后，植冠殘存的種子逐漸稀少，則將枯枝上所有種子收集。土壤種子的采集，設置5個采樣點，每一采樣點隨機選取1棵豚草植株，以植株為中心、半徑為45 cm范圍內采取植株底下表面0～5 cm的沙土，用16目的篩子篩去沙土，挑出豚草種子，用透氣袋裝好，編號后存放于實驗室陰涼處備用。為系統分析豚草種子發芽能力的變化，在種子成熟后，于每月底采集土壤和植冠上的豚草種子，分離種帶真菌，檢測種子的發芽能力。

1.3 不同的種子越冬處理

分別采用3種方法儲存豚草種子，經歷一定儲存時間的種子用于內生真菌的分離或是發芽試驗。(1)室內透氣袋儲存：將當年采集的新鮮植冠豚草種子裝入透氣袋中，置于室溫條件下儲藏。(2)野外沙土埋藏：2013—2015年，每年10月采集豚草種子用于野外種子埋藏試驗。在收集種子的同時，采集豚草生長地沙土，該沙土經過16目的篩子過篩，檢查無豚草種子殘留后用于試驗；50粒種子混入500 g沙土中，用尼龍網袋裝好，放入豚草生長地表層土壤中(0～5 cm)，使其經歷越冬；選擇有枯死豚草植株的5個埋藏點，每一埋藏點間隔至少0.5 m，至次年3月收集經歷越冬的種子，用于試驗。(3)室內沙土儲存：挑選健康、顆粒飽滿的種子400粒，放置于裝有豚草發生地沙土的花盆表層(0～5 cm)，花盆放置于實驗室內。以上3種方式越冬后的種子與在豚草發生地植冠上的種子、沙土中自然越冬的種子一起，用于分離內生真菌，比較不同越冬方式對種子內生真菌分離率和發芽的影響。

1.4 種子內生真菌的分離

豚草種子先用清水清洗以去除雜質，浸泡過夜后瀝干水分。豚草種子的表面消毒程序參照李紹鋒等[15]的方法：先用體積分數75%乙醇漂洗30 s，再經3%次氯酸鈉浸泡8 min，后在體積分數75%乙醇溶液中漂洗30 s；消毒劑處理后的種子用無菌水洗滌3次，每次5 min，以漂洗除去殘留的消毒劑。然后在超凈工作臺中適當晾干水分后接種于PDA平板上，每皿7～9粒。接種完成后，將培養皿用透氣帶封好，置于(28±1)℃恒溫下培養。待有真菌長出時，逐個挑出移接到新的平皿上進行純化、鑒定，記錄內生真菌的分離率。種子內生真菌分離率表示為培養后生長出真菌的種子數占分離用種子數的百分率。

1.5 野外調查、試驗

每年11月下旬開始，即可見枯死的豚草植株下有大量的豚草幼苗發生。采用5點取樣法，每個樣點選擇1株枯死豚草，以植株為中心，45 cm為半徑，采集植株下方深度為0～5 cm范圍內的沙土及所有幼苗，用16目的篩子篩去沙土，計算幼苗數和種子數，未發芽的種子繼續用于發芽試驗。

2014年3月下旬，在福建省長樂市松下鎮豚草自然發生地發現3株處于開花期的豚草植株，此后定點、定期觀察植株的生長情況。于2014年5月7日收獲種子165粒，其中飽滿成熟種子97粒，瘦小種子68粒；取50粒飽滿種子用于發芽試驗。

1.6 種子萌發試驗

濾紙保濕法：將培養皿底部墊上濾紙，每皿50粒種子，清水保持濾紙濕潤，于溫度為28 ℃光照培養箱中萌發；箱內濕度為70%，光周期(L ∶ D)為12 ∶ 12。記錄發芽種子數，計算發芽率，種子出現胚根即認為已經萌發；同時記錄種子腐爛、休眠和死亡等情況。種子發芽率表示為發芽種子數占試驗種子數的百分率。每個處理設置3個重復。

花盆沙土培養法：豚草發生地沙土經16目篩子過篩，除去其中的植物種子和其他雜質，均勻地將沙子分裝到5個同等大小的花盆中，用適量的清水澆濕沙土；分別將種子放置到對應花盆沙土表面，盡量模擬自然條件，每隔2 周計算發芽種子數，并將長出的幼苗拔除。發芽處理結束后，用16目的篩子篩出殘余種子，觀察分析種子的腐爛、休眠和發芽等情況。

1.7 種子生活力測定

種子生活力采用TTC (2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC) 染色法檢測[11]。種子充分吸水膨脹后，用解剖刀剝離果皮，放入1.0%的TTC染色液中，以浸沒為度，置于28 ℃的恒溫培養箱中，黑暗中進行染色反應8 h；染色完成后倒去染色液，用清水沖洗種子數次,然后觀察染色情況，判斷種子是否有生活力。

1.8 數據統計分析

采用SPSS19.0統計軟件對試驗數據進行統計分析，Origin 9.1軟件作圖，不同處理間參數的差異在0.05水平上采用Duncan法進行比較。

2 結果與分析

2.1 室內儲存種子內生真菌發生的動態變化

室內透氣袋儲存條件下，豚草種子經不同時間的儲存后，隨著時間的增長，種子內生真菌的分離率呈現逐步下降的趨勢，結果見圖1。10月剛成熟的豚草種子真菌分離率為78.14%，分離獲得的真菌種類較為豐富(結果未顯示)；存放3個月后，內生真菌分離率下降至42%；隨著儲存時間的持續延長，內生真菌的分離率明顯降低。存放9個月后，內生真菌的分離率僅為8%，與儲存3、6個月種子的真菌分離率相比，達到差異極顯著水平(P<0.01)。儲存12個月的種子難于分離到內生真菌。2010年10月從長樂采集的種子也得出類似的結果，種子存放15個月后即難于檢測到內生真菌(結果未顯示)。

2.2 不同方式越冬后種子內生真菌的變化

不同條件越冬后豚草種子中內生真菌發生情況的比較見圖2。從圖2可知，自2013年10月至2014年3月底(約為種子成熟后6個月)，自然環境中越冬的豚草種子中，植冠上種子的內生真菌分離率為73.16%，明顯高于沙土中種子(61.93%)(P<0.01)。人為用沙土覆蓋的種子越冬后，其內生真菌分離率分別為56.90%和65.88%。以上處理的種子其內生真菌分離率均明顯高于室內透氣袋保存的種子(20.07%)(P<0.01)。總體來看，內生真菌的分離率由高到低依次為植冠種子(73.16%)、沙土中種子(56.90%～65.88%)和室內透氣袋保存的種子(20.07%)。

柱狀圖上不同字母表示數值在0.05水平上差異顯著(下同)Different letters on the column show significant difference at the 0.05 level (the same below)圖1 豚草種子儲存期內生真菌的動態變化(均值±標準誤)Fig.1 Variation of isolaton rates of endophytic fungi from common ragweed seeds during the storage (average±SE)

圖2 不同越冬方式對豚草種子內生真菌分離的影響(均值±標準誤)Fig.2 Difference of isolation rate of endophytic fungi in common ragweed seeds after over-winter periods (average±SE)

2.3 自然條件下越冬期種子內生真菌變化動態

2014年，自豚草種子成熟的10月底起，逐月定期到長樂采集豚草植冠上和沙土中的種子，調查越冬期種子內生真菌的變化動態，結果見如圖3。10月份剛成熟的種子均存在于植冠上，沙土中種子稀少。11月后，落入沙土中的種子逐漸增多。11月份，植冠上和沙土中的種子其內生真菌分離率相當(P>0.05)；隨著越冬時間的增長，沙土中的種子內生真菌分離率明顯降低(P<0.01)，其中12月底內生真菌的分離率最低為38%。內生真菌的種類也發生較大的變化，新鮮的種子主要以鏈格孢屬真菌為主，隨著與土壤接觸時間的增長，來自土壤中的真菌如青霉菌和木霉菌比例增多。植冠上種子在越冬期內真菌分離率較為穩定，其中1月底內生真菌分離率最低為63.78%，其它月份內生真菌的分離率均在70%以上，真菌種類上主要以鏈格孢屬和鐮刀屬的真菌為主。總體上，落入沙土中2個月后，沙土中的種子其內生真菌分離率顯著低于植冠種子(P<0.01)。

2.4 不同越冬方式對種子發芽的影響

野外調查發現，在長樂市松下鎮寨下村豚草產地，最早于4月下旬即可有種子成熟，于2014年5月7日采獲的165粒新鮮種子(部分種子的總苞尚為青綠色)，經室內發芽試驗，發芽率可達41.18%。

自種子成熟至次年3月，經歷越冬以后殘留于植冠上的種子其發芽能力最強，可達58.11%(圖4)；野外人工埋藏的種子發芽率為53.94%，達到差異顯著水平(P<0.05)。室內沙土埋藏、室內透氣袋儲存和野外自然殘存于沙土的種子，其發芽能力則大幅度下降，比如經歷6個月的室內透氣袋存放后，發芽率僅為22.14%。

圖3 越冬期野外豚草種子內生真菌的變化(均值±標準誤)Fig.3 Dynamics of isolation rate of endophytic fungi in common ragweed seeds during the over-winter stage (average±SE)

圖4 不同越冬方式對豚草種子發芽的影響 (均值±標準誤) Fig.4 Effect of over-winter patterns on seed germination of common ragweed (average±SE)

2.5 實驗條件下土壤種子萌發動態

2015年11月從5個取樣點獲得種子2 776粒，將這些種子灑落在沙土表面，置于室外培養，觀察種子出苗情況。在近4個月的發芽試驗過程中，種子發芽隨時間的變化情況如圖5所示：在越冬的前期種子萌發較多，兩周內的發芽率達到20.87%，明顯高于其他時間段(P<0.05)；隨著越冬時間的延長，種子的發芽率總體上呈下降趨勢。3個月后，絕大多數的種子已經發芽；至2016年3月28日，經過近4個月的萌發，種子總發芽率達到70.55%。未發芽的種子經TTC染色法檢測，27.89%的種子發生腐爛，僅有1.56%的種子保持生活力。

圖5 越冬期豚草種子萌發動態(均值±標準誤)Fig.5 Dynamics of seed germination of Ambrosia artemisiifolia during the over-winter stage (average±SE)

圖6 越冬期豚草土壤種子和植冠種子發芽能力比較(均值±標準誤)Fig.6 Comparison of germination rate of soil seed and canopy seed of Ambrosia artemisiifolia during the over-winter stage (average±SE)

2.6 野外條件下豚草種子發芽的動態變化

野外定期采集落入沙土中種子和保留在植冠上的種子，調查越冬期內不同時期種子萌發能力的動態變化(圖6)。調查結果表明：當年成熟的豚草種子保持較高水平的發芽能力；當年10月份至次年1月份(種子成熟后4個月)，無論是落入土壤中的種子還是殘留在植株上的種子，發芽率均保持在40%以上。10月份采集的植冠種子發芽率最高，為86.49%，與12月(種子成熟后3個月)采集的植冠種子差異不顯著(P>0.05)，與其它月份植冠種子之間發芽率差異顯著(P<0.05)；至次年3月(種子成熟后6個月)，雖然植冠種子的發芽率明顯下降(P<0.05)，但仍然維持較高的發芽率(58.01%)。落入沙土中的豚草種子，越冬前期(當年11月至次年1月)維持較高的發芽率(55.90%～78.05%)；但是，隨著越冬期的延續，殘存土壤種子的發芽率顯著下降(P<0.05)；至次年3月，沙土中種子發芽率僅為22.50%。經歷1—2月份的低溫時期后，植冠種子的發芽率明顯高于土壤種子(P<0.01)。

2.7 豚草幼苗內生真菌檢測

室內種子萌發獲得的幼苗其真菌分離率為0，豚草自然發生地豚草幼苗真菌分離率為65.52%，差異極顯著(P<0.01)；而且，從菌落形態和菌體形態的觀察可知，自然發生地豚草幼苗中分離獲到的真菌與種子內生真菌的種類大多數不同。

3 結論與討論

豚草種子在不同條件下越冬，其內生真菌的存活能力存在明顯的差異。在室內干燥條件下，豚草種帶內生真菌的分離率隨儲存時間延長而下降，說明室內干燥的環境不利于內生真菌的存活。種子成熟后，內生真菌存活能力及其對種子生活力的影響的研究在草坪草和牧草種子中研究較多，但研究結果隨植物種類、真菌種類、菌株和生境條件不同而有差異[16-17]。室內儲存的種子隨著存放時間的延長，內生真菌逐漸死亡，真菌的死亡速度快于宿主種子的衰敗速度；但在土壤(如土壤埋藏試驗)條件下，宿主種子和內生真菌的壽命是相似的[18]。種子從植株上落到土壤表面后，種子的存活率大為上升，但種子中內生真菌的存活則大為下降[19]。Sowley 等[20]研究發現，萵苣(Primulapolyantha)種子經過4 ℃的冷藏后，種子攜帶的灰霉菌(Botrytiscinerea)分離率下降，并影響種子發芽后植株中灰霉菌的感染程度[20]。以上的研究結果說明種帶內生真菌隨種子室內儲存時間延長而死亡增多和干燥不利于種帶真菌存活，本文的研究結果支持這一結論。但在野外條件下，無論是土壤種子還是植冠種子，其內生真菌的分離率均維持在比較高的水平，與室內干燥儲存的種子相比差異顯著(P<0.05)，說明自然條件下的沙土埋藏有利于真菌存活。與土壤種子相比，植冠種子中內生真菌分離率保持較高的水平(>60%)，而土壤種子中內生真菌的分離率總體上呈下降趨勢，不同月份之間有所波動。野外條件下種帶內生真菌分離率不同月份之間出現的波動，可能與土壤真菌的活動、沙土干燥程度和種子取樣方法有關，需要作更深入的研究。自然條件下，掉落到土壤中的種子將受到土壤微生物的影響[11-12,14]。但在北美，研究結果顯示土壤真菌對落入土壤的豚草種子影響并不明顯[12,21]。和北美相比，福建省長樂市區域屬于亞熱帶季風氣候，有利于微生物如土壤真菌的繁殖和生長。因此，豚草種子、內生真菌和土壤微生物如何相互影響，需要作進一步的分析。

豚草屬于典型的短日照植物。在北美原產地，當年成熟的豚草種子不能發芽，必須經歷低于5 ℃，時間在8周左右的低溫層積(休眠)，種子才能在晚春或初夏(4月下旬—5月上旬)發芽出苗[1-2,22]。然而，豚草種子發芽和休眠特性隨分布緯度的不同而變化。如在我國遼寧省沈陽市和黑龍江省牡丹江市，當年成熟的種子不能發芽，全部進入休眠[23-24]；而在江西省南昌市，當年成熟的種子有10%沒有進入休眠，部分豚草可以冬季前發芽，以幼苗越冬[25]；在廣東省佛岡縣，豚草種子的休眠性弱，當年成熟的種子在25℃下12 d的發芽率達到64.4%[26]。Sang等[27]采集自中國黑龍江省牡丹江市、江蘇省南京市和江西省南昌市等3個地區的豚草種子，在5～40 ℃的范圍內均能發芽，種子發芽對滲透壓、pH值和光照等環境因素的適應范圍廣。但是，在5 ℃條件下，采自牡丹江市的種子其發芽率明顯高于其它兩個地區的種子，發芽的最適溫度也不一樣，這表明3個地區的種子發芽對溫度要求產生了分化[27]。豚草種子發芽的最低溫度為4.88 ℃，最高溫度為42.92 ℃，而誘導豚草種子進入二次休眠的最低溫度約為20 ℃；日照長度低于14.5 h時開始進入生殖生長，霜凍(低于0 ℃)導致植株死亡[1,22,27]。發生于福建省長樂市的豚草種子大多數不需經歷休眠即可發芽，而且成熟的豚草種子在當年絕大多數(>70%)已經發芽，以幼苗形態越冬，殘留于土壤中的活種子很少(約1.56%)。相比于沙土中的種子和植冠上的種子，干燥儲存的種子發芽率顯著下降(P<0.05)。豚草種子發芽時間不齊，發芽持續的時間很長(約4～6個月)。福建省東南沿海地區(如長樂市松下鎮)，冬季的溫度、光周期和無霜期天數等氣候條件均滿足豚草生長發育的最低要求，這些氣候條件的滿足，可能是導致豚草周年發生的原因。發生于福建省長樂市的豚草，與原產地北美(如加拿大和美國)[1,22]和入侵地歐洲(如德國和匈牙利)[28-29]相比，其種子休眠、越冬和發芽等生物學特性已經發生明顯的變化。

發生于福建省長樂市的豚草維持一定數量的植冠種子；與室內干燥儲存種子和土壤中的種子相比，經歷越冬后豚草的植冠種子維持較高的發芽率。植冠種子庫是指所有宿存于植冠上的成熟種子形成的種子庫。由于每次只掉落幾粒種子，使得種子傳播時間延長，能持續補充土壤種子庫，提高種子的繁衍和擴散效率。同時，植冠種子由于不接觸土壤，因而大大減少土壤侵蝕、腐爛性微生物和小型動物的破壞，也延長種子壽命，提高種子成活率,使得植物能夠適應不確定環境，因此在荒漠和火燒生態系統中受到廣泛的關注[30]。豚草土壤種子庫的研究資料非常豐富[1,31-32]，但有關豚草植冠種子庫的研究未見報道。由于大多數生活力強的種子在當年即已發芽，在經歷較為寒冷的冬季(1—2月)以后，殘存于土壤中的種子發芽能力大為下降，而植冠種子的發芽能力仍然強勁，與土壤種子相比差異顯著(P<0.05)。豚草的植冠種子庫對維持自然種群和促進入侵可能發揮重要的作用。

豚草種子實質上是一種瘦果，由堅硬、致密的果殼(總苞和苞片)包裹胚(種子)，對胚起到保護作用，促進胚的休眠[31]。豚草種子(瘦果)的內生真菌主要存在于總苞和苞片中，胚中相對較少[15]。本研究中，由種子發芽獲得的幼苗內生真菌的分離率為0，說明種子中的真菌并沒有垂直傳播至幼苗。發生于福建省長樂市的豚草種子休眠能力大為減弱，當年發芽率提高，除了地理和氣候的影響之外，是否也和內生真菌有一定的關系[12,33-34]，需要作進一步的分析。