棉花內生芽孢桿菌LH-L3定殖能力研究

陳麗華，何鵬飛，歐曉慧，袁德超，吳毅歆,，何月秋,*

(1.云南農業大學植物保護學院，云南昆明650201；2.云南農業大學農學與生物技術學院，云南昆明650201；3.微生物菌種篩選與應用國家地方聯合工程研究中心，云南昆明650217)

植物內生細菌廣泛存在于植物的組織或細胞內，它們與寄主植物建立和諧共存的關系，具有促生、固氮、抗病蟲害、殺線蟲等多種作用[1-4]，目前已被廣泛應用于農業生產。生防菌株能在根際土壤或植株體內成功定殖是所有抑菌機制的基礎，內生細菌的定殖是其與寄主植物互作發揮其自身作用的關鍵步驟。隨著生物技術和顯微鏡技術的發展，植物內生菌或病原菌在植物體內侵染、定殖的檢測越來越容易[5]。目前檢測菌株定殖情況的方法有很多，其中綠色熒光蛋白標記目標菌株越來越普遍[6]。

甲基營養型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)LH-L3(下稱LH-L3)是本實驗室從健康棉株葉片中分離獲得的內生細菌，平板對峙試驗表明其對多種病原菌有抑制作用，并對棉花黃萎病有很好的防病作用，且具有促生長效果[7]。研究生防菌 LH-L3在棉花上的定殖情況，有助于進一步了解該菌株的防病促生機制。為了測定LH-L3的定殖能力，本文通過自然轉化法獲得了 GFP 標記菌株，并對其定殖情況進行跟蹤檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：LH-L3(CGMCC No.12565)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、玉米大斑病菌(Exserohiumturcicum)為本實驗室分離保存，棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)由中國農業科學院棉花研究所李志芳博士惠贈。

質粒和抗生素：pHT01-P43GFPmut3a由本實驗室自行構建，攜帶GFP基因和氯霉素(Cm)抗性基因，氯霉素使用終濃度為10 μg/mL。

作物：玉米(云禾單2號)為實驗室自選種；甘藍(中甘21)、小麥(昆麥5號)和蠶豆(鳳豆6號)購于市場；棉種(冀棉11)由李志芳博士惠贈。

培養基：細菌培養采用LB培養基，真菌培養采用PDA培養基，菌株LH-L3的自然轉化采用GCHE和GC培養基[7]。

1.2 LH-L3的自然轉化

參照何鵬飛[8]提供的方法。挑取新鮮劃線的LH-L3單菌落于液體LB中，37 ℃ 160 r/min振搖過夜培養；次日吸取LH-L3培養物于液體GCHE培養基中，使其光密度值OD600在0.3左右；37 ℃ 160 r/min振搖培養3～3.5 h，待其OD600達到1.4左右，加入等體積的GC培養液，稀釋混勻，37 ℃ 160 r/min繼續培養1.5～2 h；將此時的細胞培養物均勻分成兩份，5 000 g室溫離心6 min；吸取上清液200 μL懸浮菌體沉淀后，加入2 mL轉化緩沖液及1 μg的外源DNA；混勻后，37 ℃溫箱放置1 h，期間每隔10～15 min輕輕顛倒混勻；加入含亞致死濃度的相應抗生素的LB液體，37 ℃ 160 r/min振搖培養2～3 h后；10 000 r/min室溫離心4 min，取上清液400 μL重懸菌體沉淀，均勻涂布于含相應濃度氯霉素的LB平板上；次日觀察有無抗性菌落的出現，在光電折射儀上觀察菌落是否發出綠色熒光。挑取發綠色熒光的單菌落于含有氯霉素的液體LB中擴大培養，并將該標記菌株定名為LH-L3-P43GFPmut3a(以下簡稱為LH-L3-GFP)。

1.3 LH-L3-GFP與野生型LH-L3菌株的室內拮抗活性比較

采用平板對峙實驗[9]比較LH-L3-GFP和野生型LH-L3菌株對不同植物病原真菌的室內拮抗活性，其中植物病原真菌以棉花黃萎病病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌為試驗材料。觀察標記菌是否具有相同或者更強的拮抗能力，對比兩者的拮抗帶寬度，以此來判斷其LH-L3-GFP是否適用于定殖研究。

1.4 LH-L3-GFP在棉花體內的定殖

挑取過夜培養于氯霉素LB平板上的LH-L3-GFP的單菌落，于含有氯霉素的LB液體培養基中37 ℃振蕩培養3 d，形成抗逆性較強的內生芽孢。棉花種子經75%酒精表面消毒無菌水漂洗3次后，播種于經2次滅菌的土壤中，約50 d后開始出現花朵時，用LH-L3-GFP菌液(106cfu/mL)進行灌根處理，同時設定清水對照，每處理重復3次。

回收檢測菌LH-L3-GFP在根表土、根、莖、葉、花朵內的定殖情況，分別于處理后1,3,5,7,10,25,50 d取樣。方法：將整棵棉花輕輕拔出，抖落根系上的土壤顆粒，然后用毛筆輕輕將附著在根系的土壤顆粒刷下，即為根表土壤樣品，稱質量后依次加無菌水進行10倍稀釋，取稀釋了100、1 000倍的土壤溶液100 μL均勻涂布于含有氯霉素抗性的平板上，每個處理重復3次，37 ℃培養48 h。用無菌剪刀將根、莖、葉、花朵分開，其中從最下層葉片至基部的部分為莖，各部分別稱質量后，棉株經75%酒精浸泡2 min，無菌水漂洗3次后剪成小塊于無菌研缽中充分研磨至勻漿，然后進行10倍稀釋，按上述方法每個濃度吸取100 μL涂布培養，菌落長出后，置于光電折射儀上統計綠色熒光的菌落數量，計算含菌量。

因生長至開花時的棉株根莖較硬，不易切片，所以按上述方法播種棉種后于棉株2葉期進行澆菌處理。選擇處理第1天和第5天的棉株，用無菌水清洗表面泥土，采用徒手切片法制片，在激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica，DE)下觀察GFP標記菌株在棉株體內的定殖情況。

1.5 LH-L3-GFP在不同作物體內的定殖

該部分采用葉面涂抹菌液和灌根兩種接種方式進行。將蠶豆、小麥、玉米和甘藍種子表面消毒后，于培養皿中進行催芽，種子出芽3 d時，將其轉移至離心管中，并使其根浸泡于4 mL水中，所用物品均經過滅菌處理。

葉面涂抹接種：在確保葉片不被擦傷和離心管中的水不被污染的條件下，用滅菌棉棒蘸取菌液(濃度約為106cfu/mL)，輕輕涂抹幼苗的葉片。

灌根接種：加入400 μL菌液(濃度約為107cfu/mL)于離心管的水中。

將處理幼苗置于28 ℃光照培養箱中培養，每處理重復3次。于處理后24 h和72 h取樣，稀釋涂板檢測，方法與1.4一致。

2 結果

2.1 菌株LH-L3的自然轉化

按照上述方法，成功將質粒pHT01-P43GFPmut3a導入LH-L3自然感受態細胞中，轉化成功的菌株能夠在終濃度為10 μg/mL的氯霉素平板上生長，且在光電折射儀上菌落發出綠色熒光(圖1)。

2.2 LH-L3-GFP與野生型LH-L3菌株的室內拮抗活性比較

圖 1 光電折射儀下LH-L3的GFP標記菌株 Fig.1 GFP-tagged LH-L3 under optical refract meter

野生型菌株LH-L3對多種植物病原菌都有較強的室內拮抗活性，從圖2可以看出，與野生型相比較，LH-L3-GFP對病原真菌稻瘟病菌、玉米大斑病菌、黃萎病菌的拮抗力無明顯差異，可用于定殖和生物防治的研究。

2.3 LH-L3-GFP在棉花體內和根際的回收監測

W.T為LH-L3野生型菌株，GFP為LH-L3-GFPW.T mean wild type,GFP mean LH-L3-GFP strain圖2 LH-L3及其GFP標記菌株的抑菌效果Fig.2 Inhibitory effect of LH-L3 and its GFP-tagged strain on fungal pathogens

通過灌根的方法，接種1 d后，標記菌LH-L3-GFP在棉株各器官上的定殖如圖3-D、E、F，在激光共聚焦顯微鏡下清楚地觀察到主根伸長區、莖的薄壁組織，甚至葉部組織中都有標記菌的存在；接種5 d后，熒光信號更加強烈，在莖表皮和皮層中大量聚集。在分離培養實驗中，結果與上述切片觀察的結果符合，由圖4可以看出在處理的第1天，標記菌就能從下至上地侵入，在根表土、根、莖、葉、花朵等器官中回收到的菌落數分別為3.00×105，2.25×105，3.50×104，1.20×102，1.00×102cfu/g；第3、5天時，根表土中標記菌數量有所下降，但至第7天時又出現緩慢上升趨勢，定殖數量一直維持在104～105cfu/g；根中標記菌數量除第3天時有所下降，之后一直維持在105cfu/g左右；莖中標記菌數量隨處理時間的延長有所變化，但定殖數量一直維持在104cfu/g左右；葉片和花朵中標記菌數量變化不大，后期基本保持不變，均在101～102cfu/g。處理的第50天，仍然可以從棉株體內和根表土中回收到標記菌，說明該GFP標記菌具有很強的穩定性，同時說明菌株LH-L3能夠在棉花體內穩定定殖。

A、B、C分別為根、莖、葉對照；D、E、F分別為接種1 d后標記菌在主根伸長區、莖的薄壁組織中、葉部組織中的定殖；G、H、I分別為接種5 d后標記菌在主根伸長區、莖表皮和皮層的定殖、葉海綿組織的定殖A,B and C were root,steam and leaf control,respectively.D,E and F mean colonization in the main root elongation area,parenchyma of the stem and leaf tissue after 1 day of inoculation,respectively.G,H and I mean colonization in the main root elongation area,stem epidermis and cortex and leaf sponge tissue after 5 days of inoculation,respectively圖3 LH-L3-GFP在棉花根、莖、葉中的定殖Fig.3 The colonization of GFP-tagged strain,LH-L3-GFP in cotton root,stem and leaf tissues

2.4 LH-L3-GFP在不同作物體內外的回收監測

圖4 LH-L3-GFP在棉花體內和根際的定殖Fig.4 The colonization of LH-L3-GFP in cotton parts and root rhizosphere

采用葉面涂抹和灌根的接種方式，分別檢測生防菌從葉片定殖至根部、根部定殖至葉片的情況。結果(圖5)顯示，葉面涂抹標記菌24 h，菌株可到達這4種作物幼苗的莖部；處理72 h菌株可到達小麥、甘藍幼苗的根部，在蠶豆幼苗體內的定殖能力最強，甚至在浸泡根部的水中都能回收到菌體，在玉米體內的定殖能力稍弱，僅在葉片和莖部檢測到菌體的存在。采用灌根接種的方式，依然發現該菌株在蠶豆體內定殖能力較強，處理24 h即可在莖部回收到菌體。除此之外，甘藍莖部也可回收到菌體，而菌株在小麥、玉米體內仍然只存在于根部；處理72 h菌株均到達這4種作物莖部，葉片上回收不到菌體。因此，該菌株能在蠶豆、小麥、玉米、甘藍體內定殖，其中在蠶豆體內的定殖能力比在其他3種作物體內的定殖更強。

A、B分別為葉面涂抹接種24，72 h標記菌在不同作物體內和體外的回收菌體數量；C、D分別為灌根接種24，72 h標記菌在不同作物體內和體外的回收菌體數量A and B mean the number of bacteria collected in different crops applied to the leaves for 24 hours and 72 hours,respectively.C and D mean the number of bacteria collected in different crops after drenching inoculation for 24 h and 72 h,respectively 圖5 LH-L3-GFP在不同作物體內和體外的定殖Fig.5 The colonization of LH-L3-GFP in different crops

3 討論

從人類意識到化學農藥對環境造成的嚴重危害開始，生物防治就越來越受到重視。目前，有益微生物介入在生物防治領域占有重要地位。這種措施能在改善作物生長和產量的同時確保人們消費和生態環境的安全[10]。生防菌在根際土壤或植株體內中不能成功地定殖，其他所有的抑菌機制都沒有真正的生防價值[11]。因此，研究菌株LH-L3在棉株及不同作物上的定殖情況極其重要。

目前，在對生防菌株定殖能力的檢測中，使用較多的為抗生素標記法[12]和GFP標記法。與抗生素標記法相比，GFP 標記法具有易于檢測、靈敏度高、穩定性較好、構建載體方便等優點，從而受到了科研工作者的廣泛應用[13]。由本實驗室構建的GFP質粒pHT01-P43GFPmut3a，其芽孢桿菌復制子來源于低拷貝枯草芽孢桿菌質粒pBS72。用該質粒對菌株進行GFP標記，所得菌株穩定性較高。近2個月的取樣調查中依然能在玉米組織中回收到標記菌，并且標記菌株生長速率較快[8]。本實驗室已使用該質粒對多個生防菌株進行標記[14]，成為同時具有熒光特性和氯霉素抗性的標記菌。

本次實驗基于前人的基礎上，成功對菌株LH-L3進行了GFP標記，并采用澆灌菌液的方法，研究標記菌株LH-L3-GFP在棉株體內的定殖，結果顯示菌株在24 h就實現了自下而上的轉移，定殖能力由大到小依次為根、莖、花朵和葉，數量呈現“減—增—減”的變化趨勢，且根部數量變化波動不大，在跟蹤了近兩個月的時間內，菌株在棉株的各個器官內均還能檢測出，表明LH-L3菌株在棉株體內定殖情況較好。

此外，筆者還研究了菌株在蠶豆、玉米、小麥、油菜上的定殖能力。結果顯示菌株在這4種作物上均能定殖，定殖能力由大到小依次為蠶豆、甘藍、小麥和玉米。涂葉72 h能在整株蠶豆、甚至培養的水中檢測出菌的存在，灌根24 h能在蠶豆和甘藍的莖中檢測出菌的存在。出現這種差異可能與棉花、蠶豆、甘藍都屬于雙子葉作物有關，因此猜測該菌株在雙子葉作物體內的定殖能力優于單子葉作物。而通過灌根接種，在這4種植株葉片上均回收不到菌體，這也有可能是因為到達葉片里的菌量較少，而筆者仍然用同一尺度進行檢測，經過研磨稀釋后導致濃度過低未檢測出來，具體原因仍有待進一步探究。LH-L3的良好定殖能力，為其用于多種作物病害生物防治和促生長提供了條件。