非洲紫羅蘭離體葉片不定芽的誘導(dǎo)及植株再生

呂德任，任軍方，符瑞侃，梁定民，王景飛，黃 賽，戚華沙

(海南省特種經(jīng)濟(jì)植物種質(zhì)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所，海南 海口 571100)

1 引言

非洲紫羅蘭(Saintpaulia ionantha wendl)又名非洲堇，為苦苣苔科非洲紫羅蘭屬多年生常綠草本[1，2]，其花色艷麗,株型小而美觀，是較受歡迎的小型盆栽花卉。非洲紫羅蘭原產(chǎn)地為非洲坦桑尼亞，現(xiàn)世界各地廣泛栽培，被譽(yù)為“室內(nèi)花卉皇后”，其極有市場開發(fā)前景[3]。我國對非洲紫羅蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)研究起于上世紀(jì)90年代，1999年王蓮輝等人以非洲紫羅蘭的莖段、嫩葉及葉柄作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果僅有莖段誘導(dǎo)出愈傷組織進(jìn)而分化出不定芽[4]。至今，多處見有非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)研究報道[5～8]，為其開發(fā)利用提供了較多的技術(shù)支持。本試驗(yàn)對非洲紫羅蘭葉片繁育種苗的相關(guān)環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究，建立起離體繁殖技術(shù)和植株再生體系，旨在實(shí)現(xiàn)可持續(xù)開發(fā)利用和工廠化育苗。

2 材料與方法

2.1 材料

非洲紫羅蘭盆苗種植于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所生物技術(shù)室，取健康新葉片作為外植體。

2.2 外植體滅菌

早上9：30陽光照射曬干葉片上的露珠后，用刀片切取非洲紫羅蘭葉片，自來水清洗，用棉花沾適量稀釋洗潔精擦葉片表面，自來水清洗；移入超凈工作臺放入無菌瓶中，無菌水清洗2次，75%酒精搖蕩10 s，無菌水清洗1次，0.05%HgCl2消毒4 min，無菌水清洗3次，3%NaClO浸泡5 min，無菌水清洗4次。

2.3 葉片不定芽誘導(dǎo)

消毒好的葉片切成約1.50 cm×1.50 cm方塊，背面向下接入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基分別設(shè)置為6-BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L、6-BA1.0mg/L+NAA0.2 mg/L、6-BA1.5mg/L+NAA0.2 mg/L和空白對照(CK)，共4組對比。每瓶接3個外植體，每個處理接種5瓶，3次重復(fù)，35 d統(tǒng)計(jì)不定芽平均誘導(dǎo)率和平均芽數(shù)。

2.4 不定芽增殖培養(yǎng)基篩選

挑選單芽約1.00 cm作為試驗(yàn)材料，培養(yǎng)基分別設(shè)置為6-BA 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L與NAA0.2 mg/L、0.5 mg/L組合，共8組對比。每瓶接3個外植體，每個處理接種5瓶(試驗(yàn)實(shí)際每個處理接種8瓶，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)未污染材料5瓶)，3次重復(fù)，35 d統(tǒng)計(jì)不定芽增殖系數(shù)和生長情況。

2.5 不定芽生根培養(yǎng)基篩選

采用繼代增殖苗約1.5作為試驗(yàn)材料，設(shè)置NAA1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L，添加1g/L活性炭，共4組對比。每瓶接3個外植體，每個處理接種5瓶，3次重復(fù)。35 d統(tǒng)計(jì)不定芽的平均生根率及根的生長情況，篩選出非洲紫羅蘭適宜生根培養(yǎng)基。

2.6 移栽

生根苗移至大棚練苗15 d后，瓶蓋打開30 min，然后將苗從培養(yǎng)瓶中取出，用清水洗去根部殘留的培養(yǎng)基，分別栽植于下列基質(zhì)中：河沙∶椰糠(V1∶V5)、表土∶椰糠(V1∶V5)、紅土∶椰糠(V1∶V5)、珍珠巖∶椰糠(V1∶V5)，共4組對比。每種基質(zhì)各栽種20株，3次重復(fù)。種后澆透定根水，蓋上透明塑料薄膜，每7 d澆一次水，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2.7 數(shù)據(jù)處理分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析。

統(tǒng)計(jì)方法：平均誘導(dǎo)率(%)=(誘導(dǎo)總數(shù)/接種總數(shù))×100%；平均芽數(shù)(個)=芽總數(shù)/接種總數(shù)；增殖系數(shù)=增殖后芽數(shù)/接種總數(shù)；平均生根率(%)=(生根總株數(shù)/接種芽數(shù))×100%；平均根長(cm)=根長總數(shù)/接種總數(shù)；平均根數(shù)(條)=根總數(shù)/接種總數(shù)；平均成活率(%)=(成活總數(shù)/移栽總數(shù))×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同激素種類組合對不定芽誘導(dǎo)的影響

不同激素種類組合對非洲紫羅蘭不定芽誘導(dǎo)的影響差異極大(表1)。葉子接入不同培養(yǎng)基中，9 d見有葉片邊緣產(chǎn)生少量愈傷組織，15 d葉片向下卷曲，隨后葉片邊緣和上表皮出現(xiàn)綠色小芽點(diǎn),25～35 d小芽點(diǎn)長成大量不定芽(圖1)。在不定芽平均誘導(dǎo)率方面，6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L處理，平均誘導(dǎo)率為最高值，達(dá)100%，其次為6-BA1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L處理，平均誘導(dǎo)率為95.56%，兩者間差異不顯著。在平均芽數(shù)方面，6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L處理，平均芽數(shù)最多，達(dá)4.80個，其次為6-BA1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L處理，平均芽數(shù)為4.22個，兩者間差異達(dá)到顯著水平。因此，非洲紫羅蘭不定芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L。

表1 不同激素種類組合對不定芽誘導(dǎo)的影響

A=0.05

注:相同字母表示差異不顯著。

圖1 不定芽

3.2 不同激素種類組合對不定芽增殖的影響

不同激素種類組合對非洲紫羅蘭不定芽增殖的影響效果不同(表2)，從數(shù)據(jù)整體來看，6-BA1.0 mg/L和6-BA2.0 mg/L與NAA的兩種濃度組合，增殖系數(shù)大于15；6-BA0.5 mg/L和6-BA4.0 mg/L與NAA的兩種濃度組合，增殖系數(shù)小于10。從數(shù)據(jù)組合來看，6-BA2.0 mg/L與NAA兩種濃度組合的增殖系數(shù)差異不顯著，6-BA0.5 mg/L與NAA兩種濃度組合的增殖系數(shù)差異不顯著，6-BA1.0 mg/L和6-BA4.0 mg/L與NAA兩種濃度組合的增殖系數(shù)的差值分別為0.66、1.60，這可能說明非洲紫羅蘭不定芽增殖主要的影響因子是6-BA，NAA為輔助因子或者對增殖沒起影響作用。從增殖系數(shù)來看，6-BA2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L處理誘導(dǎo)的增殖系數(shù)最高，增殖系數(shù)達(dá)18.60，且不定芽健康，顏色艷綠(見圖2、圖3)。綜合考慮分析，MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為非洲紫羅蘭適宜增殖培養(yǎng)基。

圖2 6-BA2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L處理的不定芽增殖

3.3 不同NAA濃度對不定芽生根的影響

不同NAA濃度對非洲紫羅蘭的生根效果不同(表3、圖3)。在含NAA1.0 mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35 d后，小苗的根粗、苗健壯，誘導(dǎo)生根率達(dá)91.11%；在含NAA2.0 mg/L和NAA3.0 mg/L的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)出的根短、苗健壯，生根率分別為84.44%和82.22%；在含NAA4.0 mg/L的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)出的根短且細(xì)，生根率為73.33%。從表中數(shù)據(jù)可以看出，在NAA1.0～4.0 mg/L的范圍內(nèi)，隨著NAA濃度增加，生根率有所下降，這可能說明，非洲紫羅蘭適合較低濃度的生根劑進(jìn)行培養(yǎng)。方差分析結(jié)果顯示，NAA1.0 mg/L與其它處理的生根率差異達(dá)到顯著性水平。因此，培養(yǎng)基 MS+NAA1.0 mg/L為非洲紫羅蘭適宜生根培養(yǎng)基。

表2 不同激素種類組合對不定芽增殖的影響

3.4 移栽

非洲紫羅蘭組培苗移栽成活率較高，其中在表土∶椰糠(V1∶V5)的混合基質(zhì)上移栽，成活率達(dá)86.67%(圖4)；在珍珠巖∶椰糠(V1∶V5)的混合基質(zhì)上移栽，成活率達(dá)75.00%；在紅土∶椰糠(V1∶V5)的混合基質(zhì)上移栽，成活率達(dá)70.00%；在河沙∶椰糠(V1∶V5)的混合基質(zhì)上移栽，成活率達(dá)86.67%，這可能是因?yàn)楸硗梁鸵坊旌希梢詾榉侵拮狭_蘭組培苗提供更多養(yǎng)分，而珍珠巖和椰糠混合，基質(zhì)的通透性良好有利于根系發(fā)育。移栽時，注意澆透定根水，蓋上透明塑料薄膜，并每7 d澆一次水，以保證移栽環(huán)境適度降溫，相對濕度較高等條件。

表3 不同NAA濃度對不定芽生根的影響

圖3 不同NAA濃度對非洲紫羅蘭的生根效果

圖4 非洲紫羅蘭在表土∶椰糠的混合基質(zhì)上移栽結(jié)果

4 結(jié)論

利用組織培養(yǎng)技術(shù)對非洲紫羅蘭進(jìn)行快繁，可為市場提供大量優(yōu)質(zhì)種苗，而在離體培養(yǎng)增殖過程中，增殖系數(shù)對種苗的數(shù)量和整個技術(shù)能否工廠化生產(chǎn)應(yīng)用有著決定性的影響[9]。

在本研究中，以MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽的生長，增殖系數(shù)達(dá)18.60，增殖系數(shù)極高，為下一步的生根壯苗提供了充足的材料。非洲紫羅蘭組培苗移栽喜于通透性良好且富含營養(yǎng)的基質(zhì)，組培苗移栽于表土∶椰糠(V1∶V5)和珍珠巖∶椰糠(V1∶V5)的基質(zhì)上，成活率達(dá)75.00%以上，并且植株生長狀態(tài)良好，滿足可持續(xù)開發(fā)利用和工廠化育苗。