黃河三角洲冬棗SSR引物的開發與設計

陳杰敏，鞏 銳，李 慧，高春明,2,3

(1. 濱州學院 生物與環境工程學院，山東 濱州 256600； 2. 濱州學院 山東省黃河三角洲生態環境科學重點實驗室，山東 濱州 256600； 3. 濱州學院 黃河三角洲野生植物資源開發利用工程中心，山東 濱州 256600)

1 引言

冬棗(ZiziphusjujubaMill. cv. dongzao)隸屬于鼠李科(Rhamnaceae)，棗屬(ZiziphusMill.)，是無刺棗樹的一個晚熟鮮食優良品種，主要分布于山東、河北、山西、陜西等地。冬棗原產于山東省濱州市沾化縣，目前是黃河三角洲重要的耐鹽堿經濟植物[1]。近些年，分子標記已被廣泛應用與遺傳變異、多樣性檢測、保護生物學、分子生態學及疾病檢測等各領域[2]。SSR(Simple Sequence Repeats)分子標記是基于PCR原理的分子標記，傳統的SSR標記的開發方法成本高，而隨著二代測序技術的飛速發展，也為SSR引物的開發提高了效率[3]。過去有學者對棗的SSR引物進行了開發[4]，但關于黃河三角洲地區冬棗的SSR引物開發較少。

目前冬棗的葉綠體基因組已被報道[5]，本研究主要利用冬棗葉綠體基因組，對其SSR引物進行開發和設計，為冬棗資源的進一步開發利用打下基礎。

2 方法

通過NCBI下載冬棗的葉綠體基因組(No.MF781071)，利用MISA軟件[6]對冬棗的SSR位點重復序列進行分析，重復序列的類型包括單核苷酸(mononucleotides)、二核苷酸(dinucleotides)、三核苷酸(trinucleotides)、四核苷酸(tetranucleotides)、五核苷酸(pentanucleotides)、六核苷酸(hexanucleotides)，各類型個數參數分別設置為 10、5、4、3、3和 3。 根據結果利用Primer 3.0 在線軟件(http://primer3.ut.ee/)對冬棗的SSR引物進行設計。

3 結果與分析

3.1 冬棗葉綠體基因組SSR位點分析

通過對葉綠體基因組分析，共得到簡單重復序列90個，包括單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸，并沒有檢測到六核苷酸的SSR位點。冬棗葉綠體基因組檢測到的90個SSR位點，其中65個(72.2%)為單核苷酸類型，12個為二核苷酸類型，占13.3%，4個為三核苷酸類型(4.4%)，7個為四核苷酸類型，占7.8%，而五核苷酸類型有2個，占總數的2.2%。在冬棗的所有的SSR位點中，序列富含A或T堿基，只有6個位點含有部分C或G堿基。冬棗的SSR位點序列長度為10～17bp。90個SSR位點序列中6個位于rpoC2、rpoB、ycf1和cemA的基因編碼區，14個位于基因的內含子內，其余的70個序列全部位于基因間隔區。同時，90個位點中73個位于葉綠體基因組的長單拷貝序列區(LSC)，13個位于短單拷貝序列區(SSC)，4個位于反向重復序列(IR)內SSRs被廣泛用于居群多樣性及分子進化研究[7]。在本研究中，和其他植物相同，冬棗的SSRs位點富含A或T堿基，并且大多數SSR位點均位于葉綠體基因的非編碼區[8]。

3.2 冬棗SSR引物設計

根據對葉綠體基因組SSR位點的分析，利用primer3.0對冬棗進行了引物設計(表1)共設計引物11對，長度為20～23bp。

4 結論

通過對冬棗葉綠體基因組進行分析，共檢測到冬棗SSR位點90個，并依此設計了11對冬棗的SSR引物，為黃河三角洲地區冬棗資源的遺傳分化及進一步的開發利用奠定基礎。

表1 冬棗SSR引物的設計