t-PA溶栓治療腦卒中優化方法研究進展*

唐巍巍，熊 可，李 楠，王 爽，于亞君，晏一淇，張 晗

（天津中醫藥大學中醫藥研究院生物學部，天津 301617）

腦卒中是僅次于心肌梗死的第二大死亡病因，也是導致殘疾的主要原因[1]。腦卒中分為缺血性腦卒中（IS）、蛛網膜下腔出血性腦卒中和腦出血性腦卒中3種類型，其中80%為IS。IS是一種由腦血流中斷、組織缺血和神經細胞凋亡引起的疾病。糖尿病、高血壓病史、心臟等原因是卒中的危險因素。中國每年腦卒中的病死率約為160萬[2]，腦卒中治療負擔日趨加重。目前，組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）療法是唯一經過美國食品藥品監督管理局（FDA）認證的治療腦卒中的方法[3]。但由于t-PA溶栓治療的時間窗非常狹窄，并且使用t-PA溶栓后會出現腦出血、再梗死和再灌注損傷等并發癥。研究發現，目前只有31%的腦卒中患者在t-PA溶栓后3～6個月后康復[4-6]。因此，想要更多的IS患者受益，就需要研究新的藥物或治療方法來減輕t-PA溶栓后產生的不良并發癥或延長t-PA治療時間窗。

1 t-PA溶栓機制及并發癥產生機制

1.1 t-PA溶栓機制 正常情況下，人體內凝血和纖溶系統處于動態平衡狀態，IS發生時，這種動態平衡被破壞，t-PA可調節血管內皮細胞的纖溶特性，并通過酶促反應使纖溶蛋白酶原轉化為纖溶蛋白，進而使交聯纖維蛋白降解[7]，達到溶栓的效果。

1.2 t-PA溶栓后并發癥產生機制 腦缺血和缺血后再灌注會導致腦毛細血管功能障礙，使血腦屏障毛細血管的通透性發生改變。缺血引起的毛細血管通透性改變經歷離子性水腫，血管性水腫，出血性轉化3個階段。當血腦屏障（BBB）的完整性遭到破壞，BBB不能繼續維持血管內成分的穩定，水、鈉離子、血液、血清蛋白等物質進入大腦，造成腦水腫，這是再灌注損傷和出血性轉化（HT）的共同原因。

HT是使用t-PA溶栓療法治療IS后產生的最令人擔憂的神經血管并發癥。其發病機制是t-PA能上調和過度激活基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達，溶栓后通過增加MMP-2和MMP-9活性來增加BBB損傷和缺血性腦出血癥狀的危險性[8]。基質金屬蛋白酶（MMPs）家族由至少25個鋅結合蛋白水解酶家族組成，它們消化細胞外基質（ECM），在哺乳動物的中樞神經系統中起重要的生理作用。其中MMP-2和MMP-9的表達增加可能導致缺血后潛在的神經血管的破壞、腦組織和腦細胞外基質損傷的第一階段。MMP-2和MMP-9的過表達使EMC蛋白降解和內皮細胞的損傷，從而導致神經炎癥和毒素分子進入大腦，最終造成大腦損傷。因此MMP-2和MMP-9在增加BBB膜通透性上起到關鍵的作用。早期的BBB損傷是導致致命的溶栓后出血的主要危險因素[9]。

t-PA引起的血腦屏障損傷通常可加速腦缺血等疾病的進程，增加細胞毒性和神經毒性的癥狀[4]。據文獻報道，腦缺血時，BBB血管膜蛋白的降解是BBB損傷的主要原因，BBB在新的治療方法中起到關鍵性的作用。因此，任何以保護BBB為中心靶點、減少t-PA溶栓后對BBB損傷的治療方法，均可改善t-PA溶栓治療后產生的細胞毒性、神經毒性和HT癥狀，并且擴大t-PA溶栓治療的治療時間窗[10-11]。

2 t-PA溶栓治療優化方法研究進展

2.1 優化t-PA溶栓療法潛在靶點 小窩蛋白-1（Caveolin-1）是小窩蛋白的主要結構，它在胞吞、囊泡運輸、信號轉導中起到關鍵的作用。Caveolin-1病理條件下會通過阻斷緊密連接蛋白導致BBB損傷[12]。據文獻報道[8，13]，t-PA 可以通過增加內皮細胞中Caveolin-1的表達從而提高細胞外MMP-9水平，敲除Caveolin-1后內皮細胞中MMPs的活力降低。因此，Caveolin-1可能作為IS使用t-PA溶栓后出血性并發癥的治療靶點。

t-PA+常壓氧（NBO）+EtOH或低溫聯合使用可明顯降低促凋亡蛋白的表達和促進抗凋亡蛋白表達從而來保護神經使神經存活[4]。血管生成素樣蛋白4（Angptl-4）是一種分泌蛋白，它是由血管內皮細胞和心肌細胞缺氧缺血損傷產生的[14]。t-PA和Angptl-4聯合使用可以減少梗死體積，改善神經功能障礙，Angptl-4可能通過防止血液不流通保護血管從而對抗急性心肌梗死，它可能成為一個新的中風治療靶點[15-16]。

2.2 t-PA溶栓療法風險預測 血腦屏障是一個通過嚴格調節分子、離子和細胞流量的動態平衡從而保護腦血管的選擇性屏障。內皮細胞（EC）、細胞間緊密連接（TJ）、細胞外基質（EMC）是BBB的主要結構成分。EC可以限制跨細胞和細胞旁分子的運動。TJ和EMC是維持BBB完整性的主要組成部分。TJ蛋白主要由閉合蛋白（claudins）和閉鎖蛋白（occludin）構成，形成了血腦屏障的第一道屏障[17]。EMC的主要成分為基底膜和間質充質，它的主要功能為支撐血管內皮細胞的血管組織。EC、TJ和EMC三者能夠共同維持BBB內環境的穩定。Occludin是一個BBB結構中重要的緊密連接蛋白，IS時Occludin通常會遭到破壞，從而導致 BBB 損傷[12，18]。研究顯示[9]，血液中Occludin蛋白水平與中風早期階段BBB損傷程度有很大的關系：在大腦中腦動脈動阻塞（MCAO）發生前4.5 h由腦缺血引起的Occludin蛋白水平增加具有時間依賴性，4.5 h后Occludin蛋白水平急劇增加；腦缺血時，2個主要的Occludin蛋白碎片被確認。據實驗證明[19]，Occludin蛋白被MMPs和Caspase-3降解成55kDa和31kDa兩種，其中31kDa蛋白在血液種的水平可反應BBB損傷程度；在MCAO發生的前24 h血液中Occludin蛋白能夠保持明顯高于基礎水平。另有研究表明[20]，由于在無出血轉化的患者循環血液中Occludin蛋白水平幾乎為0，所以Occludin在預測患者出血轉化上好于claudin-5。由以上可見，Occludin蛋白水平可以作為臨床相關的生物標記來評估使用t-PA療法之前患者ICH風險。

2.3 t-PA溶栓療法并發癥的改善 膜聯蛋白Ⅱ（Annexin A2）是plasminogen和其激動劑t-PA的細胞表面受體。在高血糖刺激7 d人腦微血管內皮細胞（HBMEC）的實驗中[21]，高血糖可引起Annexin A2功能障礙，從而導致整體細胞表面纖溶活性降低，當加入重組Annexin A2（r-A2）孵育后，高血糖引起的細胞表面纖溶活性降低癥狀可得到恢復。另有研究表明[22-23]，r-A2可減少大鼠體內頸動脈和大腦中動脈血栓的形成，由此可見Annexin A2在溶栓過程中起到重要作用。Annexin A2能與Annexin A2輕鏈（S100A10或P11）、plasminogen和纖維蛋白酶原激動劑t-PA形成一個四聚體[24]。與單獨使用同樣劑量的t-PA相比，四聚體能夠使plasminogen轉化為plasmin的轉化率提高60多倍并且可以提高t-PA的藥效[24]。與傳統大劑量使用t-PA相比，r-A2聯合低劑量t-PA使用可以改善局灶性栓塞腦卒中大鼠的的溶栓再灌注效應，明顯促進纖溶，減少死亡率、腦梗死、出血性轉變，延長中風再灌注治療時間窗，為腦卒中的預后治療提供了一種安全、有效的方法，同時為臨床治療的基礎研究提供了理論依據[7，25-26]。

激活或抑制蛋白激酶C（PKC）同工酶被認為對缺血后的血管具有保護作用，PKCε可防止活性氧的生成和細胞內的損傷[27]。PKCα和PKCδ可使BBB的緊密連接結構和功能的完整性得到損傷[28]。PKCε通過上調claudin-5表達增強BBB的完整性，而PKCδ通過改變緊密連接蛋白定位來增加血腦屏障的通透性[29]。PKCα和PKCδ是ERK1/2分裂原激動蛋白激酶通路的初始階段，它們可以調節MMP-9的激動。MMPs過分的激活和表達可引起內皮細胞的損傷，導致膠原、黏蛋白和層黏連蛋白基質的分裂，最終引起細胞的遷移和炎癥反應的發生，大量有毒分子進入大腦[30]。苔蘚抑素是一個PKC調節劑，據文獻報道[31]，老年雌性大鼠在MCAO 2 h給予苔蘚抑素，6 h給予r-tPA可以降低腦水腫，提高存活率。苔蘚抑素可明顯上調PKCε的活力，降低中風后MMP-9的表達，但不影響MMP-2的表達，減少BBB緊密連接蛋白的損傷和降低t-PA再灌注損傷后出現出血現象的風險，延長t-PA治療時間窗促進有效安全溶栓。

西洛他唑是一個選擇性磷酸二酯酶Ⅲ抑制劑、抗血小板藥物，它通過增加cAMP和環鳥苷酸cGMP水平擴張血管[32]。cAMP依賴性誘導claudin-5的表達以增強腦毛細血管內皮細胞緊密連接的屏障功能。研究表明[33-34]，西洛他唑具有神經保護效應，并且可以對抗缺血性腦損傷，能夠減輕MCAO再灌注的大鼠的腦梗死面積，可通過使缺血損傷最小化來改善急性缺血性中風癥狀。西洛他唑不僅具有神經保護功能，它還可以對抗t-PA治療缺血后再灌注引起的出血轉化。據文獻報道[11]，西洛他唑與t-PA聯合使用可減輕腦水腫，擴大溶栓治療時間窗，通過降低MMP-9的活力來保護內皮細胞的損傷，通過抑制claudin-5表達的降低抑制BBB的開放，這些改變明顯降低了再灌注小鼠18 h和7 d后的發病率和死亡率。另有文獻報道[35]，西洛他唑與其他抗血小板藥物相比能夠減弱出血副作用并不增加出血時間，對所有類型中風患者二次保護的療效優于阿司匹林，保護患者不受二次出血性中風。由此可以推測磷酸二酯酶抑制劑Ⅲ可能是潛在的治療t-PA引起出血并發癥的藥物。

牛磺酸最早從牛黃中分離出來，據研究報道[36-37]，其可通過多種機制在急性缺血性腦損傷中發揮神經保護作用。例如，牛磺酸可通過抑制內質網應激和維持細胞內Ca2+穩態來下調缺血/缺氧和谷氨酸誘導的神經細胞凋亡[38]。牛磺酸還可以通過抑制NF-κB信號通路減少細胞因子和中性粒細胞的產生從而抑制腦缺血炎性反應[39]。CD147是一種基質金屬蛋白酶的誘導劑，研究表明[40]，牛磺酸可通過抑制CD147依賴性MMP-9信號通路降低缺血性腦血管內皮細胞的出血性轉化風險，在大鼠卒中后4 h使用牛磺酸和6 h后與t-PA聯用，可以擴大t-PA的治療時間窗至6 h，改善大鼠長期功能缺損。因此牛磺酸與t-PA聯用可能成為治療腦卒中的新型療法。

3 結語

t-PA是目前治療IS的一線藥物，但其狹窄的時間窗和復雜的并發癥限制了患者的臨床獲益。優化t-PA溶栓療法有助于減少溶栓后的不良并發癥，改善患者愈后癥狀等。其中中藥治療腦卒中具有多靶點、多途徑、不良并發癥少的特點，因此中藥治療腦卒中也成為了近些年的研究熱點[41-42]，但是中藥治療腦卒中的機制靶點有待進一步研究。