犬新鮮冰凍血漿的制備及應用

杜志國，尹 月，王 洋，高曉琦，郭 穎，尹燕博

(1.青島農業大學動物醫學院,山東 青島 266109 ; 2.延邊大學農學院，吉林 延吉 133000；3. 北部戰區總醫院實驗動物科,遼寧 沈陽 100016 ; 4.青島博隆實驗動物有限公司,山東 青島 266200 ; 5. 北部戰區總醫院輸血科,遼寧 沈陽 100016)

輸血療法是輸入正常血液或血液成分進行補血、止血、解毒的治療措施，在治療一些危重病例時具有重要作用。近年來，寵物臨床上使用輸血療法的情況逐漸增加。目前，國外普遍用成分血制劑替代全血制劑，這種做法不但節約了血液資源，還降低了輸血風險。成分血制劑是在一定條件下，用物理方法分離出全血內的一種或幾種血液成分而制成的血液制劑。血液采集后，在規定時間內分離出的血漿，放置于-50 ℃溫度以下速凍后即為新鮮冰凍血漿。犬新鮮冰凍血漿功能主要有：改善凝血能力，大幅度提高血漿蛋白濃度，治療嚴重低蛋白血癥、低血容量、惡病質等，補充缺少初乳的幼犬體內的免疫球蛋白IgG[1]。隨著對新鮮冰凍血漿應用了解加深，目前臨床上更多的用新鮮冰凍血漿治療凝血能力缺乏，如抗凝血殺鼠劑中毒，遺傳性或獲得性凝血因子缺失等[2]。輸注血漿的過程是有一定風險的。建立嚴格供血犬質量標準，特別是血傳病原體檢測標準，可有效控制因輸血傳播疾病的風險。嚴格按照操作規范制備、儲存和運輸血漿，不僅確保凝血因子和血漿蛋白不被破壞，也可有效降低輸血時的不良反應。為保障犬新鮮冰凍血漿的質量與生物安全，我們參照《血站技術操作規程》[3]，從供血犬的篩選、血傳病原檢測、血液的采集、新鮮冰凍血漿的制備、運輸等方面，開展了如下研究。

1 材料與方法

1.1 供血犬 健康狀況良好的比格犬，執行了完善的免疫、驅蟲程序，性格溫順，服從性強，頸靜脈暴露清晰，紅細胞壓積不低于40%，體重10 kg以上，年齡1-8歲[1,4-6]，無輸血史及血液傳染病史[4,7-8]。

1.2 主要儀器 低溫保存箱(-86 ℃)、血液冷藏箱(儲血冰箱)、高頻熱合機、微電腦采液控制器(采血稱)、血液分漿夾、低溫低速大容量離心機、電子天平、一次性使用塑料血袋(多聯袋)、血細胞分析儀、采血架等。以上僅提供采集、制備犬新鮮冰凍血漿的基本儀器，滿足其采集、制備的最低要求。一些檢測項目需要在專業的實驗室進行檢測。

1.3 采血量及采血間隔 為保障動物福利，根據相關文獻[1,6,7,9]采取了適當補充營養，采血量不超過全部血量的20%，間隔21 d的方法。

1.4 病原檢測 檢測項目為：無形體屬(Anaplasmaspp)，巴貝蟲屬(Babesiaspp)，巴爾通體屬(Bartonellaspp)，埃立克體屬(Ehrlichiaspp)，嗜血支原體(Hemoplasmas)，利什曼原蟲屬(Leishmaniaspp)，犬布魯菌(Brucellacanis)[10-11]。可根據地區流行情況適當增減。

1.5 血液采集

1.5.1 采血前準備 采血前對供血犬種群的健康狀況進行檢查，檢測血常規，抽驗血傳病原與某些病毒的抗體滴度，合格后方可采血；檢查采血器材并核實采血耗材清單，采血環境消毒；供血犬獻血前禁食(可不禁水)，剃除頸部毛發，檢測體溫。

1.5.2 采集血液 適當保定并安撫供血犬，使之情緒穩定。拇指按住頸部嵌窩處，即頸靜脈近心端，用食指指腹觸摸頸部皮膚并確定頸靜脈位置、走向和粗細程度，根據觸摸情況確定穿刺位點和進針路徑。穿刺部位消毒后，進行靜脈穿刺。如需進行2次穿刺，應在供血犬情緒穩定后，在頸部另一側選擇穿刺部位。如犬情緒緊張，出現不配合表現，應停止采血，廢棄未采到規定量的血袋，按醫療廢棄物管理規范集中處理。

靜脈穿刺成功后，松開導管上的止流夾，使采集的血液直接進入采血稱上的采血袋。血液開始流入采血袋后，固定針頭位置，打開采血稱搖擺開關，自動混勻血液。維持靜脈穿刺點與血袋之間的落差，利用重力保持血流通暢。血流不暢時，及時調整針頭位置。

1.5.3 留取樣本 采血時同步留取樣本，其檢測結果用于判定血液能否合格。

1.5.4 血袋及血液樣本標識 對同一供血犬的血袋、樣本管和采血記錄進行統一標識。經核對后，在采血袋、樣本管、血袋導管標記同種編號，并在記錄單上詳細記錄采血時間，供血犬耳號，血袋編號，導管編號等信息。采血袋、樣本管和采血記錄的標識連續完成，不得中斷。血液采集后盡快保存在血液運輸箱中，以待進一步處理。

1.5.5 熱合 根據導管上的編號分段熱合血袋導管并記錄導管編號，以供交叉配血、血型復查和血液樣本保存使用(見中插彩版圖1)。逐一檢查熱合部位，如有滲漏的情況，應重新熱合，并評估對血液樣本無菌性的影響。熱合分離采血針頭，將其放置在專用的利器盒內，統一處理。

1.5.6 采血現場整理 檢查采集的血液、樣本及記錄單信息一一對應，保證準確無誤；盤點并記錄物品消耗；整理廢棄物，用環境消毒劑擦拭操作臺及采血器材并進行環境消毒。

1.6 新鮮冰凍血漿的制備 將血袋(聯袋，見中插彩版圖2)放于低溫大容量冷凍離心機的離心杯中，配平離心(±5 g)，離心力5 000 g，離心時間5 min。離心結束后，在離心機中取出離心杯，從離心杯中取出血袋，避免振動，進行檢查，觀察離心效果、血袋及其導管有無滲漏，離心杯中有無血跡，如有破損應查找滲漏點。血袋破漏的，應作消毒和報廢處理[3]。

檢查完成后，將血袋豎直放置于血液分漿夾中，將各導管附帶的止流夾移動到連通器處并使之處于關閉狀態。將空的衛星袋放置于電子稱上，電子秤歸零并打開相應導管的止流夾。一切準備就緒后，輕輕掰開血袋出口處的阻塞塞，此時處于血袋上層的血漿會通過導管流入空的衛星袋(見中插彩版圖3)。第1次重離心后將盡可能多的血漿轉移至衛星袋，在衛星袋上作與血袋相同的標識，完成后熱合斷離，生成1袋血漿。血漿中紅細胞混入量少(目視觀察)時，可繼續進行下一步操作，如血漿紅細胞混入量較多，應當再一次進行離心，離心完成后把上清血漿轉移至其他衛星袋。

將分離的血漿編號(要與之前的編號分開并且能相互對應)并完善標簽。完成后將血漿放于-80 ℃環境中速凍，注意速凍時要平鋪放置，不可堆放。速凍完成后，即為新鮮冰凍血漿，可將其存放于-20 ℃以下的環境中，保質期1年，期滿后可作為冰凍血漿使用，保質期在原有的基礎上再加4年。整個制備過程應在血液采集后6-8 h內完成。

1.7 生物安全檢測 將熱合的小段導管或樣本管中的血液進行血傳病原檢測、無菌檢測。血傳病原檢測利用血液涂片和PCR手段，無菌檢測利用血瓊脂培養基培養樣本進行檢測。根據檢測結果剔除不合格的血漿。

1.8 運輸 利用厚度為35～40 mm高密度泡沫保溫箱作為運輸容器。通過查閱文獻[12]并結合實際進行調整，運輸容器內部構造從底層開始依次為：蓄冷劑、吸水紙、緩沖帶、犬血漿、緩沖帶、吸水紙、蓄冷劑、容器蓋。冷卻劑為干冰和化學冰袋，并在血漿袋之間放置適量化學冰袋。每個血漿袋都單獨包裝在一個封閉的塑料袋中，防止意外導致的泄露。

2 結果

2.1 采血后供血犬狀態 采血709例，因供血犬掙扎，不能很好配合造成采血失敗36例(5.07%，36/709)，其中因掙扎，進針方向等問題造成皮下淤血12例(5.04%，12/238)。供血犬采血后未出現明顯不適癥狀。采血失敗，皮下淤血等并未引起其他不良反應。

2.2 質量與管理 離心后出現不明原因溶血32例(4.75%，32/673)，其余均達到使用要求。血傳病原、無菌檢驗全部為陰性。每袋血漿標識明確，均可追溯到相應供血犬。

2.3 運輸安全性 通過快遞、汽運等方式運輸16次，試驗前期出現融化現象1次，改進后未發現因運輸造成的包裝破損、血漿融化等現象。

2.4 臨床輸注結果 臨床輸注新鮮冰凍血漿1 197例，醫師反饋使用效果良好。除個別表現為體溫略微升高外，未發現其他不良癥狀。在本單位輸注新鮮冰凍血漿55例，用于嚴重脫水、凝血因子缺乏及重危病例，病犬康復效果明顯。其中3例出現單純發熱癥狀，治療后恢復正常；1例為突發性四肢僵直，停止輸注后癥狀消失；過敏反應2例，表現為臉部腫脹，體溫升高，抗過敏治療后癥狀消失，未見其他不良反應。

3 討論

Bernard F.Feldman、Jenny Helm、R.L.Lucas認為供血犬體重應為22.6～25 kg以上[1,5-6]，國內張海斌、梁永春提出供血犬體重應為10～20 kg[13-14]。我們通過比格犬的采血試驗發現，10 kg以上的比格犬完全可以承擔供血犬的任務。目前經國際標準確定的血型為8種，每個血型采用“DEA+數字”方法進行命名[15-16]。DEA1.1和DEA1.2是DEA1血型的兩個亞型，抗原性最強，分布廣泛，是引發急性溶血性輸血反應的主要原因。目前DEA1血型的檢測手段已十分成熟，但其他血型的快速檢測手段仍然處于開發階段。根據現有條件，將供血犬血型分為DEA1陰性與陽性兩類。由于犬體內不存在DEA1.1、DEA1.2、DEA4和DEA6的天然抗體[17]，如果僅是制備血漿的情況下，可以不對供血犬進行血型檢查。如果隨血漿同步制備紅細胞懸液，則必須檢測供血犬血型。為了減少病原體的傳播，所有采集的血液都應進行血傳病原檢測。供血犬采血前進行的血傳病原檢測結果不能代替相應血液制劑中的血傳病原檢測。

建立嚴格供血犬質量標準，按照操作規范制備、儲存和運輸犬新鮮冰凍血漿，是保障其質量與生物安全的基礎。我們通過參考人類血站的操作規程，并經多次實踐得出了適用于寵物臨床的操作流程。在犬新鮮冰凍血漿的制備、儲存、運輸、追溯性與生物安全性等方面，已趨于成熟，形成了自己的規范。但仍存在不足，如供血犬的保定與安撫問題、血傳病原的檢測手段仍未達到國外先進水平等。

通過大量臨床輸注，發現本方法制備的新鮮冰凍血漿安全性高，療效顯著。雖有少量病例發生輸血反應，但癥狀輕微，及時發現，對癥治療后，輸血反應均很快消失，臨床未發現其他損害。上述結果證明，我們建立的工藝流程、技術標準是可行的，設施、設備及工作環境是可靠的，產品的儲存、運輸方式也經得起實踐的檢驗，這些工作為建立專業動物血站提供了參考。