奶牛代謝紊亂與褪黑素應用研究進展

文/姚昱君 郭江鵬 張 魯 路永強 劉國世＊

（1 中國農業大學動物科學技術學院；2 北京市畜牧總站）

75%的疾病發生在奶牛產后第1個月，尤其是營養代謝類疾病，是指機體代謝功能紊亂形成的疾病。產前3 周到產后2 周左右是奶牛圍產期，圍產期奶牛體內新陳代謝發生巨大的變化，這一時期發生代謝紊亂嚴重阻礙奶牛的生長發育，損害生產性能，易形成奶牛繁殖障礙，如繼發性不孕癥[1]影響生殖周期。

1 奶牛代謝紊亂的發病原因

奶牛產后真胃變位，前胃遲緩，機體炎癥造成奶牛食欲下降，采食量低，導致機體營養供應不足。高產奶牛泌乳、妊娠和分娩期間營養需要增加，即便是提高奶牛產后飼料營養、改良飼料適口性增加奶牛采食，奶牛攝入的養分依然無法平衡機體能量損失。機體只能通過調節代謝，動員不同組織能量儲備，形成奶牛負能量平衡狀態（Negative Energy Balance，NEB），NEB是代謝疾病的病理學基礎。產后奶牛攝食量不足[2]，飼料能量物質過高，碳水化合物和干物質比例過低、飼養員技術經驗不足，都會導致NEB形成，進而導致代謝紊亂。奶牛攝食量低、食欲不振，既是代謝紊亂的癥狀，也是產生的原因。

1.1 酮病的發生原因

1894年，Lande首次提出奶牛酮病的概念[1]，奶牛酮病又被稱為奶牛醋酮血癥，其特征是血液、尿液和牛奶中酮水平升高，血糖降低。奶牛酮病有多種類型，分為原發性、繼發性、營養型和自發型。

在N E B期間，奶牛通過分解脂肪和蛋白平衡機體的能量需求，脂肪分解產生甘油三脂（Triacylglycerol，TAG）使血液中游離脂肪酸（Freefattyacid，FFA）濃度增加，FFA通過肝細胞β-氧化作用釋放能量生成酮體[3]。同時奶牛體內激素水平受代謝紊亂影響，血糖濃度下降，胰島素分泌減少，胰高血糖素分泌增多。垂體葡萄糖受體激活，促進腎上腺素的分泌。β-氧化作用受到胰高血糖素刺激和胰島素抑制。三種激素共同作用，使酮體生成增多，從而形成酮病。

1.2 脂肪肝的發生原因

脂質超過肝臟自身氧化和分泌的能力，在肝臟積累形成脂肪肝，泌乳早期超過50%的奶牛會出現甘油三脂（Triacylglycerol，TAG）積累，30%～40%的奶?；加兄卸戎靖?，5%～10%的奶?；加兄囟戎靖蝃4]。

健康情況下，TAG被肝臟水解，或者通過將TAG轉化為極低密度脂蛋白（Very Low Density Lipoprotein，VLDL）的形式排出肝臟，VLDL是轉運TAG的主要方式?；贾靖蔚哪膛?，機體將肝臟無法代謝分泌排出體外的多余脂質，以TAG的形式貯存在肝臟中，脂質積累導致肝臟代謝能力下降。脂肪肝奶牛體內VLDL合成減少，TAG無法及時排出肝臟，在肝臟內形成脂質積累。反芻動物與非反芻動物相比，脂肪肝發病率更高，可能與VLDL合成速度低有關。

脂肪肝患病早期，奶牛會出現食欲不振，體重減輕，產奶量下降，尿酮濃度升高等癥狀，嚴重時肝腎衰竭或心臟驟停。脂肪肝經常伴隨其他肝臟疾病發生，與機體各組織器官密切相關。研究發現，脂肪肝導致高產奶牛后續受孕率降低，機體出現炎癥和潰瘍，分娩間隔時間延長，顯著影響生殖性能，嚴重時導致心肌炎，腎臟、卵巢、子宮和肌肉組織的壞死。

1.3 酮病與脂肪肝的關聯

酮病和脂肪肝的發生都與代謝紊亂形成的NEB有關[5]。代謝紊亂導致機體生成高濃度的非酯化脂肪酸（NEFAs）和β-羥基丁酸（β-hydroxybutyrate，BHBA），增大肝臟負擔，導致肝臟脂質積累，肝臟是機體代謝的重要場所，肝臟疾病影響糖異生過程，繼而誘發酮病和脂肪肝，酮病產生的NEFA損傷肝臟，脂肪肝被認為是酮病的征兆[6]，二者相互作用。與健康奶牛相比，患有代謝疾病的奶牛共發現524 個肝臟基因表達差異顯著，其中10%與新陳代謝有關，脂質代謝和糖異生的關鍵基因顯著上調[4]。兩種疾病通過不同的機制，損傷奶牛肝臟，對器官組織產生不可逆的損傷。

2 代謝紊亂損傷雌性動物生殖機能

隨著動物營養科學及遺傳育種研究快速發展，奶牛產奶量及奶品質大幅度提高。其繁殖性能在近五十年中并未隨著科技的進步而增加，甚至還有所下降。近期研究表明，高產奶牛代謝紊亂疾病是奶牛繁殖性能降低的主要原因之一[7]。

發生酮病或脂肪肝的奶牛，血液中NEFA、BHBA、乙酰乙酸（Acetoxyacetic Acid，AcAc）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GTP）等物質的濃度會隨著機體代謝的變化而升高[8]。酮病奶牛血液中NEFA濃度超過1. 0 mmol /L，被用作檢測代謝類疾病的指標。NEFA本身具有脂毒性，產生ROS引發氧化應激，損傷機體[9]，同時影響內質網壓力發生變化，增加機體內細胞凋亡[10]。NEFA或其相應的酰基輔酶A能夠通過結合特定受體直接改變信號傳導途徑，或改變蛋白質結構和功能，間接改變信號傳導途徑。NEFA激活TLR-4和MAPK途徑，啟動NF-κB信號傳導途徑，增大細胞炎癥反應[3]。肝病奶牛體內的卵母細胞質量和發育潛力顯著低于健康奶牛[11]，高濃度的BHBA和葡萄糖損傷卵母細胞成熟和胚胎發育潛力[12]，高濃度的BHBA和γ-GTP抑制牛卵母細胞MII期發育[13]。

代謝紊亂引起激素分泌發生變化。NEB動員脂肪分解，直接抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌，同時影響促卵泡素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌激素（E2）、孕酮（P4）、瘦素（Leptin）等分泌[14]。卵巢排卵過程受到抑制，優勢卵泡無法及時排出，形成卵泡囊腫，引起卵巢發生病變。酮病奶牛體內胰島素含量較低，胰島素具有刺激牛卵泡細胞發育的功能[15]，肝病奶牛卵泡液中生長因子濃度較低[16]，多種因素共同影響機體無法順利發情，卵泡和輸卵管中卵母細胞和早期胚胎發育受阻，最終不僅導致奶牛妊娠率減低，流產率升高[17]，而且可能出現子宮機能減退等現象。

肝臟脂質積累會增加機體對炎癥刺激的敏感性，使奶牛患病率增加，容易形成肝炎。肝臟的變化導致GHR-1A（GH受體），IGF-I，IGFBP 3、4、5、6（多種IGF結合蛋白）和胰島素樣生長因子酸不穩定亞基（Insulin-like growth factor acid-labile subunit，IGFALS）的濃度降低，IGFBP-2增加，導致IGF-I的循環濃度和半衰期顯著下降，卵泡成熟受阻，雌二醇的合成能力降低，排卵延遲。

代謝紊亂使免疫細胞受到過氧化反應損傷，免疫功能降低[18]。體內和體外的實驗已經證實高濃度的NEFA損傷免疫細胞，免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）和外周血單核細胞γ-干擾素（IFN-γ）[19]受NEFA影響降低。BHBA增多，白細胞數量減少，免疫細胞功能隨之下降[20]。機體免疫力低下，更易患感染性疾病，如乳房炎和子宮炎，炎癥抑制胚胎發育，影響產犢后子宮修復[4]。

3 褪黑素與營養代謝疾病

褪黑素（MLT，n-乙酰-5-甲氧基色胺）是一種主要由松果體分泌的吲哚類激素。在哺乳動物中，色氨酸轉化為5-羥色胺，AANAT將5-羥色胺轉化為n-乙酰-5-羥色胺，經過HIOMT的催化，最終生成褪黑素。

光線和視覺影響交感神經支配褪黑素合成。光照強度變化刺激視網膜神經節細胞去極化，經視神經刺激下丘腦視交叉上核，下丘腦視交叉上核通過突觸后神經節網釋放腎上腺素，作用于松果體。松果體調節AANAT酶的表達和活性，調節褪黑素合成與分泌。脊椎動物血液中的褪黑素水平有明顯的晝夜節律性，夜間水平較高，日間分泌較低[21]。

已知兩種褪黑素受體為褪黑素膜受體（MMR）和褪黑素核受體（MNR），其中褪黑素膜受體分為MT1、MT2和MT3三種。MTl和MT2都是G蛋白耦聯受體，廣泛分布于神經系統、心血管系統、免疫系統和生殖系統[22]。MT3屬于還原酶家族，存在哺乳動物各種組織和器官中[23]，與其他親水性或親脂性抗氧化劑相比，褪黑素的兩親性使它更容易穿過所有形態生理障礙，可以保護整個細胞免受氧化損傷[24]。褪黑素獨特的生理特性使其在代謝紊亂的調節中發揮重要的作用。

3.1 褪黑素緩解代謝紊亂

褪黑素緩解代謝紊亂主要與褪黑素保護肝臟的功能有關。肝臟是人體主要代謝器官，作為機體的中轉站，在糖、脂、蛋白質和氨基酸代謝中起重要作用。在妊娠和哺乳時期，機體需要大量的能量和營養，能量需求的變化使肝臟負擔增加，此時肝臟易發生病變[25]。

褪黑素強大的抗氧化功能保護肝臟，直接清除自由基，包括O-，H2O2，OH，ROO，1O2，NO，ONOO-等多種自由基；激活抗氧化酶，提高抗氧化酶活性及基因表達[26]。增強其他抗氧化劑活性[27]，保護抗氧化酶免受氧化損傷[28]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（GSH-Rd）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）[29，30]等活性和表達量都提高；減少有害物質產生，如丙二醛（M D A）和次氯酸（H y p o c h l o r o u s a c i d）減少[31]；抑制增加氧化應激酶的活性和相關基因的表達，如一氧化氮合酶（NOs）[32]、黃嘌呤氧化酶（XO）的活性和表達量降低，下調HO-1基因的表達。褪黑素具有降血脂的功能，促進膽固醇轉化為膽汁酸，抑制膽固醇合成和受體的活性。體內的總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）減少，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）增多；褪黑素具有抗炎性，可以減少促炎細胞因子，如白細胞介素-1（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉化生長因子β（TGF-β）在體內含量減少，自然殺傷細胞（NK cell）增加；防止NLRP3炎性小體活化，硫氧還蛋白結合蛋白2（TXNIP）表達增加，中性粒細胞浸潤減少。抑制氨基轉移酶發揮作用，如丙氨酸轉氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉氨酶（AST）活性降低；線粒體氧化磷酸化反應過程產生大量ROS，無法利用常規的抗氧化劑進行清除，褪黑素獨特的雙親性保護細胞線粒體免受損傷，提高線粒體氧化磷酸化效率，減少線粒體電子漏，減少自由基生成[33]。褪黑素抑制固醇調節元件結合蛋白（SREBP-1c）活化，SREBP-1c靶基因下調，阻止脂多糖lps誘導的肝臟脂質堆積[34]。

此外，褪黑素可以抑制雌激素缺乏和內質網應激引起的肝臟脂肪變性。外源性褪黑素對去卵巢（OVX）大鼠肝臟脂質積累和細胞氧化應激均有抑制作用，褪黑素可減輕OVX大鼠肝臟脂肪變性和細胞氧化應激損傷[35]。microRNA（miRNA）是基因調控的關鍵調節因子，miRNA功能障礙是代謝疾病的共同特征，miR-23a調節ER應激。褪黑素緩解衣霉素誘導的脂質積累，通過控制miR-23a表達機制和Ca2+穩態，降低肝細胞的ER應激，在改善ER應激誘導的肝脂肪變性和炎癥中起關鍵作用，可用作藥理學試劑保護肝免受ER應激誘導的代謝功能障礙[36]。

3.2 褪黑素參與代謝節律性調節

機體代謝受到晝夜節律的調控，機體生物鐘通過調節代謝關鍵步驟和反應底物，實現代謝途徑的時間調節。目前已知的生物節律調節因子有去乙?；福⊿IRT1）和單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）。兩者與生物鐘機制聯合作用，參與哺乳動物生理代謝與生物節律調節。褪黑素連接光周期和機體內各種節律，參與調節機體節律性[37]，并且可以改善由于晝夜節律紊亂造成的能量代謝變化[38]。另外，褪黑素的晝夜節律性參與調節生殖活動，主要通過調節性腺軸改善機體生殖的功能，改善卵巢功能和卵泡發育，在后期繼續影響胎兒發育[39]。

3.3 褪黑素增強機體的免疫功能

褪黑素作用于免疫細胞，促進抗體生成，提高機體對抗體敏感性，增強抗體作用。褪黑素作用于淋巴細胞，促進淋巴因子釋放，提高免疫成分活性，促進淋巴細胞增殖，增加免疫器官重量[40]。針對病毒和寄生蟲等外部應激原，褪黑素使尚未激活的免疫系統提前進入興奮狀態，實現早期免疫應答；對于短期或慢性免疫反應，如敗血癥性休克，褪黑素一方面進行負反饋調節，一方面作為抗炎因子發揮作用。褪黑素對于免疫系統多效、多樣和復雜的作用，被形象的稱為“免疫緩沖液”[41]。

3.4 褪黑素減少代謝紊亂產生的并發癥

褪黑素作用到患病機體，有效控制疾病損傷，緩解代謝紊亂產生的并發癥，加快機體恢復[38]。褪黑素減輕乳房炎對奶牛的傷害，降低牛奶體細胞數，緩解乳房炎癥狀，促進奶牛乳房恢復健康[42]。褪黑素緩解代謝紊亂造成的奶牛雌性繁殖障礙，長期改善小鼠、豬、牛、綿羊等卵母細胞和胚胎發育，改善線粒體功能，延緩卵巢的衰老，調節胚胎新陳代謝，促進胚泡形成。褪黑素作用于黃體細胞，刺激P4分泌，增加小鼠胚胎附植點數以及產仔數。促進子宮在胚胎附植的過程中形成接受態，利于胚胎正常發育，在胚胎早期植入過程中發揮重要作用。褪黑素穿過生理屏障作用于胎盤，減少氧化應激對胎盤的損傷，降低牛的流產率。

4 展望

代謝類疾病對奶牛養殖行業造成巨大損失，多年來，一直積極尋求治療奶牛代謝疾病的方法，既要安全有效，又要符合市場對于成本的預期。褪黑素的生理功能有利于解決奶牛養殖行業諸多問題，其獨特的功效為中國乳業開發新產品提供了思路，其對于奶牛生殖和免疫方面的積極作用已經得到證實，對于代謝紊亂的調節作用也在多個物種上得到驗證，關于褪黑素與代謝的具體作用機制依然是研究的熱點，緩解奶牛代謝疾病的藥用價值還有待進一步研究。C