復(fù)合菌種對發(fā)酵鰱魚成熟過程中品質(zhì)的影響

于沛沛， 石建喜， 姜啟興， 許艷順， 楊 方， 高 沛， 余達(dá)威， 夏文水

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

我國是世界水產(chǎn)生產(chǎn)大國之一，2015年我國的水產(chǎn)品總產(chǎn)量為6 695.65萬t，其中淡水養(yǎng)殖魚類的總產(chǎn)量為3 290.04萬t。然而，我國的淡水魚加工比例不足20%，嚴(yán)重制約了我國淡水漁業(yè)的發(fā)展[1]。其中，鰱魚具有生長速度快、不易生病等優(yōu)點，且肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，其產(chǎn)量僅次于草魚。然而，由于鰱魚的肉薄刺多、土腥味較重等問題，導(dǎo)致其消費量受到很大限制[2]。腌制發(fā)酵是傳統(tǒng)的水產(chǎn)品保藏加工技術(shù)，產(chǎn)品在腌制發(fā)酵的過程中，其理化特性、微生物群及感官特性會發(fā)生很復(fù)雜的變化，最終形成產(chǎn)品所特有的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和色澤等，可以更好的滿足消費者的需求。由于傳統(tǒng)的發(fā)酵魚制品都是利用環(huán)境或魚體中自然存在的微生物發(fā)酵而成，其發(fā)酵過程往往難以控制，因而具有發(fā)酵時間長、產(chǎn)品品質(zhì)不一致、安全性低等缺點[3]。

近年來，現(xiàn)代生物技術(shù)在提升傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的研究已引起廣泛關(guān)注。將分離得到的菌種接種到產(chǎn)品中，可以有效縮短產(chǎn)品的發(fā)酵周期，并提高產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性。微生物發(fā)酵菌種以及發(fā)酵工藝條件對產(chǎn)品的風(fēng)味和食用品質(zhì)有著重要的影響。本研究室現(xiàn)有研究以淡水魚為原料，通過接種從傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚中分離得到的菌種進(jìn)行發(fā)酵，得到了具有獨特口感、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的發(fā)酵酸魚制品[4-9]。張娜[10]研究了不同的干燥條件對腌臘魚品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低溫干燥的腌臘魚品質(zhì)高于熱風(fēng)干燥。現(xiàn)有研究主要針對發(fā)酵菌種篩選、發(fā)酵過程中產(chǎn)品品質(zhì)變化等方面，而復(fù)合菌種接種對魚塊發(fā)酵和成熟的影響還鮮有報道。

因此，本研究以復(fù)合菌種（植物乳桿菌120、釀酒酵母152、木糖葡萄球菌135）作為發(fā)酵劑，在20℃發(fā)酵鰱魚塊，然后在8℃、RH 70%條件下成熟，分析接種復(fù)合菌種在發(fā)酵鰱魚成熟過程中對蛋白質(zhì)、脂肪和揮發(fā)性物質(zhì)的影響，為現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)在提升傳統(tǒng)腌制魚制品的風(fēng)味品質(zhì)的和安全性提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚：購于無錫市華潤萬家，2.5±0.2 kg/條，去頭、去內(nèi)臟，清水沖洗干凈并切成5 cm×5 cm×2 cm（長×寬×厚）的魚塊。

菌種：植物乳桿菌120、釀酒酵母152和木糖葡萄球菌135從自然發(fā)酵酸魚中分離得到，由江南大學(xué)食品學(xué)院提供。

丹磺酰氯購于Sigma；甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計：UV2100型，上海尤尼柯儀器公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀：QP2010 plus型，日本島津公司；高效液相色譜儀：1525，美國沃特世公司；其他均為實驗室常用儀器。

1.3 測定方法

1.3.1 菌落數(shù)的測定 乳酸菌、葡萄球菌及酵母菌分別用MRS培養(yǎng)基、MSA瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。檢測方法參照曾[5]，結(jié)果表示為（log CFU/g）。

1.3.2 pH的測定 稱取5 g樣品，加入50 mL蒸餾水，高速均質(zhì)1 min，然后立即測定勻漿的pH值。

1.3.3 總酸含量的測定 參照Lucke F方法[11]，稱取10 g樣品，均質(zhì)后用150 mL煮沸過的蒸餾水洗入250 mL容量瓶中，搖勻、定容、過濾后，以0.10 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定。總酸度以乳酸表示。

1.3.4 生物胺的測定 參考Ben-Gigirey B[12]方法采用HPLC法測定，并稍有修改。 HPLC條件：進(jìn)樣量：10 μL；色譜柱：Zorbax×CB C18（4.6×250 μm）；柱溫：30℃；熒光檢測器：激發(fā)波長 340 nm，發(fā)射波長515 nm；流動相：A 50%乙腈 B 90%乙腈；流速：1.0 mL/min，梯度洗脫。

1.3.5 總氮含量的測定 參考國標(biāo)GB/T 5009.5—2010，采用凱氏定氮法。

1.3.6 游離氨基酸的測定 采用茚三酮比色法。

1.3.7 TBA的測定 取2 g樣品，加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，高速均質(zhì)30 s后于4℃2 000 g離心5 min。上清液過濾，取濾液5 mL與5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液混合，置沸水浴中加熱20 min，迅速冷卻，在532 nm處測吸光值。TBA值以丙二醛（MDA）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位為mg/kg樣品。

1.3.8 FFA的測定 游離脂肪酸的甲酯化參照Gandemer G[13]方法，F(xiàn)FA組成采用GC-MS分析。色譜柱：石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm）；升溫程序：初溫為120℃，保持3 min后以10℃/min升溫至190℃，再以2℃/min升溫至220℃，保持15 min；進(jìn)樣口和檢測溫度均為250℃；載氣 （N2）的流速為3 mL/min；分流比為 1∶8；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.9 揮發(fā)性風(fēng)味化合物的測定

1）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取：采用固相微萃取法（SPME），萃取溫度為50℃，萃取時間為60 min。將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，250℃解析3 min。

2）GC-MS測定：氣相色譜條件：彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣（He）流量為 0.81 mL/min，進(jìn)樣口溫度維持在250℃，不分流進(jìn)樣。升溫程序：起始柱溫為40℃，維持3 min后以5℃/min升溫至120℃，保持5 min后以15℃/min升溫至240℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度為200℃，四級桿溫度為150℃，電子電壓為70 eV。

1.4 實驗方法

1.4.1 復(fù)合菌種的制備 將菌種（植物乳桿菌120，釀酒酵母152，木糖葡萄球菌135）活化后，培養(yǎng)液于4℃、10 000 r/min離心10 min，以無菌生理鹽水洗滌兩次，重懸于無菌生理鹽水中，最后調(diào)整菌液的質(zhì)量濃度至5～6 log CFU/mL，置4℃保存，于24 h內(nèi)使用。

1.4.2 發(fā)酵鰱魚的制備 將鰱魚魚塊在20℃條件下，置發(fā)酵罐腌制發(fā)酵48 h。然后以去離子水洗凈，瀝干后分為兩組：（1）表面涂抹混合發(fā)酵劑（比例為1∶1∶1），（2）不做任何處理。 將魚塊置 8 ℃、RH 70%的培養(yǎng)箱中成熟，成熟時間為8 d，每兩天進(jìn)行取樣并測定分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Origin 8.5統(tǒng)計作圖，利用SPASS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵鰱魚成熟過程菌落數(shù)變化

發(fā)酵鰱魚成熟過程中乳酸菌、木糖葡萄球菌和酵母菌生長情況如圖1所示。

圖1 發(fā)酵鰱魚成熟過程中微生物的變化Fig.1 Microbiological changes in silver carp during maturation

由圖1可知，混合菌種組的微生物增長顯著高于對照組。在混合菌種組，乳酸菌在第2 d到第4 d時增長迅速，從7.01 log CFU/g增長到8.15 log CFU/g，發(fā)酵后期增長緩慢；葡萄球菌從第2 d到第6 d時增長緩慢，從第6 d到第8 d數(shù)量從6.53 log CFU/g迅速增長到7.87 log CFU/g；而酵母菌的數(shù)量一直處于緩慢增長。成熟過程初期魚肉中的碳水化合物充足，乳酸菌大量生長繁殖，使得魚肉中的有機酸大量積累，而酵母菌是一種兼性厭氧菌，在無氧條件下可以將葡萄糖分解為二氧化碳和醇類，木糖葡萄球菌中的脂肪酶和蛋白酶活性能將酸和醇結(jié)合形成酯和其他風(fēng)味化合物。酵母菌是許多發(fā)酵產(chǎn)品中的主要微生物，可以在乳酸菌創(chuàng)造的酸性環(huán)境中大量繁殖[14]，具有較強的產(chǎn)香能力。

2.2 發(fā)酵鰱魚成熟過程中的pH和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

pH和總酸是影響發(fā)酵鰱魚肉品質(zhì)的重要因素，發(fā)酵鰱魚在成熟過程中的pH和總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化如圖2所示。

圖2 復(fù)合菌種對鰱魚成熟過程中pH和TA的影響Fig.2 Effect of mixed starter cultures on pH and TA of silver carp during ripening process

由圖2可知，pH值的變化與總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢相一致。在發(fā)酵鰱魚成熟過程中，接種組和對照組魚肉的pH值低于7.0，且均呈現(xiàn)出下降趨勢，隨著成熟時間的延長，下降速率增大，最終接種組的pH值4.46，對照組pH值為5.63。造成接種組和對照組pH值較低的原因主要是在成熟階段，乳酸菌在魚肉中大量繁殖，如圖1所示，涂抹混合發(fā)酵劑組乳酸菌的數(shù)量由最初的6.80 CFU/g增至成熟結(jié)束時的8.36 CFU/g；而對照組乳酸菌數(shù)量由最初的5.87 CFU/g增至7.21 CFU/g，明顯低于涂抹混合發(fā)酵組，這也說明了接種組pH值降低的幅度明顯大于對照組。乳酸菌能對魚肉中的碳水化合物進(jìn)行分解，產(chǎn)生乳酸等物質(zhì)，從而降低了魚肉的pH值；同時，成熟過程中的脂肪分解以及FFA的積累也會導(dǎo)致pH值的降低[15]，也有報道稱魚肉內(nèi)源酶或自身攜帶的微生物酶也會引起pH值的降低[16-18]。研究表明，乳酸菌不僅可以降低發(fā)酵過程中的pH值，還可以抑制腐敗菌和致病菌的生長繁殖，也能夠改變產(chǎn)品的色澤和風(fēng)味，并加速成熟過程[19-20]，達(dá)到快速發(fā)酵、縮短工藝時間的目的。

2.3 發(fā)酵鰱魚成熟后生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

發(fā)酵鰱魚成熟后的生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表1所示。由表1可以看出，接種組和對照組中的生物胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有明顯差異。食品中的腸桿菌和假單胞菌與腐胺、尸胺和組胺的形成密切相關(guān)，其所含的高活性脫羧酶使得產(chǎn)品產(chǎn)生生物胺[21]。

表1 發(fā)酵成熟后鰱魚中生物胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Mass fraction of biogenic amines in curedripening fermented silver carp

組胺、酪胺、尸胺和腐胺是發(fā)酵肉制品中的主要生物胺，而精胺和亞精胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，其中，組胺是對人體危害最大的生物胺[22-23]。一般認(rèn)為，食品中的酪胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得高于100～800 mg/kg，組胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得高于100 mg/kg[24]。接種組中的組胺和酪胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)低于這一標(biāo)準(zhǔn)，且低于對照組，可推測微生物在鰱魚風(fēng)干成熟過程中可有效抑制組胺和酪胺產(chǎn)生菌的生長。因此，在選擇發(fā)酵劑時需選擇不具有脫羧酶活性、可抑制致病菌生長的菌種，以防止生物胺在發(fā)酵和成熟階段的積累。

2.4 發(fā)酵鰱魚成熟過程中TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

發(fā)酵鰱魚在成熟過程中TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化如圖3所示，隨著成熟時間的延長，兩組中TN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均逐漸升高，與對照組相比，接種組中TN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加更加明顯，其可能是因為在成熟過程中，接種組中的微生物快速生長，所分泌的蛋白酶促使蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)轉(zhuǎn)化為風(fēng)味化合物等物質(zhì)。在成熟初期，對照組的TN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于接種組，其可能是因為成熟初期，接種組中的部分蛋白質(zhì)滲出引起的。

圖3 復(fù)合微生物對鰱魚成熟過程中總氮的影響Fig.3 Effect of mixed starter cultures on TN during silver carp ripening process

2.5 發(fā)酵鰱魚成熟過程中FAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

FAA是蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物，不僅可以直接形成滋味物質(zhì)，而且是許多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，因此FAA既可以影響產(chǎn)品的滋味又對風(fēng)味的形成有重要作用[25]。一些游離氨基酸可以通過Maillard反應(yīng)生成醛類物質(zhì)，也可以通過Strecker降解生成酮類、醇類和酯類物質(zhì)，其反應(yīng)產(chǎn)物均會對腌制魚風(fēng)味的形成產(chǎn)生一定影響[26]。發(fā)酵鰱魚在成熟過程中的FAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化如圖3所示。

圖4 復(fù)合微生物對鰱魚成熟過程中游離氨基酸的影響Fig.4 Effect of mixed starter cultures on FAA during silver carp ripening process

由圖4可以看出，F(xiàn)AA在發(fā)酵鰱魚成熟過程中呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢。FAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加主要是蛋白質(zhì)水解的結(jié)果，除了魚肉中的內(nèi)源蛋白酶外，微生物還可代謝產(chǎn)生多種外源蛋白酶，兩者均可促進(jìn)魚肉蛋白的降解[27]。成熟過程中接種的混合微生物均是有利于最終產(chǎn)品品質(zhì)的菌種，可以提高外源蛋白酶數(shù)量，因此接種組中FAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于對照組。FAA的變化取決于其形成和降解兩個反應(yīng)的相對速度，隨成熟時間的延長，Strecker降解反應(yīng)使得FAA消耗速度高于了蛋白的水解速度；而且在成熟后期可能產(chǎn)生的FAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，而主要產(chǎn)生小肽類物質(zhì)，導(dǎo)致從成熟第6 d開始FAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始減少。但相較于對照組，成熟中期接種組中FAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)不僅增加快速，而且在成熟后期，減少速率也相對緩慢，因此可知，復(fù)合微生物代謝產(chǎn)生的外源蛋白酶促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解，F(xiàn)AA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，提高了產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。

2.6 復(fù)合微生物對鰱魚成熟過程中TBA的影響

TBA可以反映脂肪第二階段的氧化程度。由圖5可以看出，隨著成熟過程的進(jìn)行，TBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，成熟結(jié)束時，對照組TBA值丙二醛由3.24 mg/kg增加至3.89 mg/kg；而接種組由于優(yōu)勢菌種的作用，其TBA明顯低于對照組，其可能是復(fù)合菌種對不飽和脂肪酸具有抗氧化作用[28]。

圖5 復(fù)合微生物對鰱魚成熟過程中TBA的影響Fig.5 Effect of mixed starter cultures on TBA during silver carp ripening process

2.7 發(fā)酵鰱魚成熟結(jié)束后FFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

發(fā)酵鰱魚成熟結(jié)束后接種組與對照組中FFA的組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表2所示。成熟鰱魚中共檢出了14種FFA，其中包括5種飽和脂肪酸（SFA）、3種單不飽和脂肪酸（MUFA）和6種多不飽和脂肪酸（MUFA）。對照組與接種組中的不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為56.03%和70.33%，其中，對照組中SFA、MUFA均高于接種組，而接種組中的PUFA則高于對照組。

鰱魚成熟工藝過程中FFA的變化是動態(tài)過程：一方面，脂質(zhì)經(jīng)水解生成FFA，F(xiàn)FA增加；另一方面，F(xiàn)FA會被氧化分解生成小分子風(fēng)味物質(zhì)，F(xiàn)FA減少。接種組中FFA（4.10 mg/g脂肪）低于對照組（4.75 mg/g脂肪），但接種組中的棕櫚酸（C16：0）、硬脂酸（C18∶0）等飽和脂肪酸明顯低于對照組，這主要是復(fù)合菌種在成熟過程中發(fā)揮了重要作用。而且，接種組中的不飽和脂肪酸（UFA）高于對照組，其中EPA與DHA明顯增加，這主要是因為pH的降低抑制了脂肪氧化酶的活性，使得不飽和脂肪酸無法進(jìn)一步降解。

表2 復(fù)合微生物對腌制成熟鰱魚游離脂肪酸的影響Table 2 Effectofmixed starter cultureson FFA concentrations generated from cured-ripening silver carp

2.8 發(fā)酵鰱魚成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分的分析

鰱魚成熟后揮發(fā)性風(fēng)味成分的組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表3所示。成熟鰱魚中的揮發(fā)性風(fēng)味成分主要包括醛類、酮類、酯類、醇類、酸類、烴類等。其中，對照組共檢出了54種風(fēng)味化合物，其中醛類7種、酮類6種、酯類10種、醇類12種、酸類4種、烴類15種；接種組中共檢出了64種風(fēng)味化合物，其中醛類14種、酮類9種、酯類13種、醇類10種、酸類3種、烴類15種。由表3可以看出，接種組與對照組中的揮發(fā)性化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異明顯，尤其是醛類、酮類和酯類化合物。由于醛類、酮類和酯類化合物的閾值較低，且其有良好的感官特性，因此對發(fā)酵鰱魚的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

烴類是原料魚中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的揮發(fā)性風(fēng)味成分，經(jīng)腌制和成熟后，對照組中的烴類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31.83%，而接種組中的烴類質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至9.82%，說明復(fù)合菌種對魚肉蛋白、脂肪和碳水化合物起到了降解作用，生成了新的風(fēng)味物質(zhì)而抑制了烴類的積累。

鰱魚中的酯類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，經(jīng)過成熟后，醇類與酸類化合物在微生物的作用下生成酯類，因而酯類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，其中接種組中酯類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)酵結(jié)束時的4.4%增長至成熟后的12.23%。

表3 鰱魚成熟后揮發(fā)性風(fēng)味成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Mass fraction of volatile compound in curedripening fermented silver carp

續(xù)表3

由表3可以看出，接種組中醛類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)52.11%，顯著高于對照組的24.51%。醛類化合物主要產(chǎn)生于脂質(zhì)氧化過程，隨著成熟過程的延長，部分醛類化合物會被氧化或還原成相應(yīng)的酸或醇。醛類物質(zhì)的閾值較低，并具有脂肪香味，因而對腌臘魚特征風(fēng)味的形成具有重要作用。一般的，5-9個碳原子的醛類化合物會產(chǎn)生令人愉快的香味。對照組和接種組中壬醛（脂肪族醛）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，具有甜香和果香。

酮類閾值較低，因而對風(fēng)味的形成具有重要貢獻(xiàn)。其中，接種組與對照組中酮類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.17%和4.58%。3-羥基-2-丁酮等甲基酮是腌臘魚中的代表酮類化合物，由飽和脂肪酸的不完全β氧化生成，與酵母菌和葡萄球菌的發(fā)酵有關(guān)。

接種組和對照組中分別檢出了10種和12種醇類化合物，包括飽和醇和不飽和醇，但對照組中的醇類質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于接種組。直鏈飽和醇類的閾值較高，因而對腌臘魚風(fēng)味的貢獻(xiàn)并不大。1-辛烯-3-醇等不飽和醇是風(fēng)干鰱魚中的主要醇類，其閾值較低，是風(fēng)干鰱魚中的特征風(fēng)味醇類物質(zhì)之一。另外，3-甲基-1-丁醇等支鏈醛一般來自碳水化合物的EMP降解或者氨基酸的埃利希降解。

接種組中酸類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于對照組，其中，乙酸是接種組和對照組中的主要呈酸物質(zhì)，由乳酸菌和葡萄球菌經(jīng)脂肪酸丙氨酸代謝產(chǎn)生。

3 結(jié) 語

通過接種復(fù)合菌種，加快了發(fā)酵鰱魚在成熟過程的蛋白水解速率，提高了總氮和游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；接種復(fù)合菌種也顯著提高了成熟后的發(fā)酵鰱魚中的EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；接種復(fù)合菌對于提高發(fā)酵鰱魚的揮發(fā)性風(fēng)味成分中的醛類、酮類和酯類化合物具有重要作用。由此可知，復(fù)合菌種對鰱魚發(fā)酵成熟過程蛋白質(zhì)的水解、脂質(zhì)水解和氧化、風(fēng)味的形成具有重要作用。