易錯PCR法提高L-氨基酸脫氨酶全細胞轉化L-異亮氨酸生產α-酮-β-甲基正戊酸效率

郭濛檬 ， 劉 龍 ， 李江華 ， 堵國成 *， 陳 堅

（1．江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2．江南大學 生物系統與生物加工工程研究室，江蘇 無錫214122）

α-酮-β-甲基正戊酸（KMV）是一種含有雙官能團的支鏈酮酸，是有機合成、藥物合成以及生物合成中的重要中間體，在醫藥和化學合成領域具有廣泛的研究與應用[1]。Huang等人研究發現KMV可以改善神經退行性疾病中出現的線粒體功能障礙和氧化應激現象[2]；有研究報道1～20 mmol/L KMV可以在低氧情況下使細胞活性增強[3]；α-酮酸還可用于治療氮代謝疾病和慢性尿毒癥，通過降低蛋白食物中氮的攝入量，降低腎過濾壓力[4]。

有氧條件下，L-氨基酸脫氨酶催化L-Ile發生氧化脫氨基反應，生成KMV和氨。L-氨基酸氧化酶也可以催化L-氨基酸生成相應酮酸，但大部分L-氨基酸氧化酶催化反應過程中生成雙氧水，而雙氧水會降低酶的活性，同時會對酮酸的穩定性造成影響[5]，因此本研究選擇L-氨基酸脫氨酶作為研究對象。Proteus[6-9]、Providencia[10]和 Morganella[11]這 3 種屬的L-氨基酸脫氨酶均位于細胞膜上。在變形桿菌屬（Proteus） 中 ，Proteus mirabilis[6-7]、Proteus vulgaris[9]、Proteus rettgeri[12]、Proteus myxofaciens[8]來源的 L-氨基酸脫氨酶均成功在大腸桿菌中表達。

與純酶轉化相比，全細胞轉化有很多優勢：易制備，成本低；更穩定，不易受環境溫度、pH等因素影響，使用方便；無污染，副產物少。目前已有多個以全細胞轉化氨基酸方式生產相應酮酸的研究報道。Hossain等人在枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中分別異源表達來自Proteus mirabilis的脫氨酶和Proteus vulgaris的L-氨基酸脫氨酶，并用構建的重組菌分別全細胞轉化L-谷氨酸、L-蛋氨酸生成α-酮戊二酸、α-酮-γ-甲硫基丁[13-14]；Hou 等人在大腸桿菌中表達來自Proteus mirabilis的脫氨酶，并用重組菌株全細胞轉化L-苯丙氨酸生成苯丙酮酸[15]；Song等人在大腸桿菌中異源表達來自Proteus vulgaris的脫氨酶，并全細胞轉化L-亮氨酸生成α-酮異己酸[16]。

本研究將來自Proteus mirabilis中的L-氨基酸脫氨酶作為研究對象。為了提高該酶對L-異亮氨酸（L-Ile）的催化能力，獲得更高的KMV產量，利用易錯PCR方法對該L-氨基酸脫氨酶進行定向進化，構建L-氨基酸脫氨酶突變庫，并結合高通量篩選方法得到催化能力提高的突變株。

1 材料與方法

1.1 相關試劑

SanPrep柱式質粒小量抽提試劑盒、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA純化試劑盒、限制性內切酶Nde I和Xho I、T4-DNA連接酶均購自TAKARA 公司（大連、中國）；GeneMorph II Random Mutagenesis試劑盒購自安捷倫公司；α-酮-β-甲基正戊酸（KMV）標樣購買于Sigma-Aldrich有限公司（MO，美國）；氨芐青霉素和IPTG購買于上海生工。

1.2 菌種和培養基

本實驗所用到的菌株和質粒如表1所示。用10 mL LB培養基培養種子液，用TB培養基對菌體進行誘導培養。LB液體培養基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，100 μg/mL 氨芐青霉素；TB液體培養基：12 g/L胰蛋白胨，24 g/L酵母提取物，4 g/L 甘油，17 mmol/L KH2PO4，72 mmol/L K2HPO4和 100 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）。

表1 本研究中所用到的菌株、質粒和引物Table 1 Strains，plasmids and oligonucleotides used in the reseach

1.3 全細胞催化劑制備

重組菌株接種10 mL LB培養基培養10 h（37℃，220 r/min），1%接種量接種 50 mL TB 培養基中，37℃條件下培養至菌液OD600為1.0左右，添加終濃度為0.21 mmol/L的IPTG，37℃條件下誘導培養4.5 h。誘導培養結束后，4℃下離心 （1 200 r/min，5 min），并收集菌體。

1.4 全細胞轉化L-Ile生成KMV

菌體用pH 8.5 Tris-HCl緩沖液洗滌一次，重懸至適當濃度。用UVmini-1240分光光度計（日本島津）測定細胞懸浮液OD600，用公式（1）計算細胞質量濃度（DCW，g/L）[13]

DCW=0.444 2×OD600－0.021 （1）

測定反應速率的反應體系為：18 g/L Ile（pH 8.5 Tris-HCl），1 g/L 細胞量（DCW），220 r/min，30 ℃，體積1 mL，反應時間20 min。反應結束后12 000 r/min離心5 min，取上清，HPLC測定反應液中KMV濃度。

1.5 用易錯PCR法對pma進行隨機突變以及突變庫構建

使用GeneMorph II Random Mutagenesis試劑盒對目標片段進行隨機突變。易錯PCR體系（50 μL）：重組質粒（pET-20b（+）-pma）作為模板，EP/pma-1和EP/pma-2作為上下游引物，各1 μL，Mutazyme II DNA 聚合酶 1 μL，dNTPs 1 μL，10× Mutazyme II反應緩沖液5 μL，用ddH2O補足反應體系。易錯PCR條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min（20～30個循環）；72℃ 5 min。將柱回收產物作為引物，進行下一輪Megaprimer PCR反應[17]。Megaprimer PCR反應體系為50 μL：質粒模板50 ng，引物500 ng，聚合酶PrimeSTAR HS預混物 25 μL，用ddH2O補足反應體系。Megaprimer PCR反應條件為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min 42 s（30個循環）；72℃ 5 min。用 Dpn I限制性內切酶消化Megaprimer PCR反應產物，37℃下酶切2 h。消化后的產物轉化E.coli BL21（DE3）感受態，進行LB抗性平板篩選。平板上所有轉化子挑到含有 1 mL LB培養基/孔 （100 μg/mL氨芐青霉和0.21 mmol/L IPTG）的96深孔板中，37℃培養。

1.6 高通量篩選方法

高通量篩選流程圖如圖1所示。將接種有突變子的96深孔板于37℃培養10 h，從中取100 μL菌液于96淺孔板中，添加50 μL 28 g/L L-Ile，混勻后于30°C轉化1 h，反應結束后，添加50 μL 60 g/L FeCl3溶液，并混勻。依照96淺孔板上顯深墨綠色孔的位置，在96深孔板中找到相應的突變株，并在5 mL離心管中分別測定全細胞轉化反應速率和全細胞轉化反應進行3 h后1 mL轉化體系中KMV的質量濃度。然后選擇反應速率較高或者KMV生成量較高的突變子，在250 mL三角瓶中測定它們在900 mmol/L L-Ile條件下的最大KMV產量：轉化體系為 20 mL，1 g/L 細胞量 （DCW），220 r/min，30℃下反應20～24 h。

1.7 α-酮-β-甲基正戊酸（KMV）測定方法

采用高效液相色譜法測定樣品中的α-酮-β-甲基正戊酸質量濃度。取0.6 mL離心后的轉化液上清，用0.45 μm孔徑濾膜過濾，所得濾液即為待測試樣。色譜條件為：Agilent 1260型高效液相色譜儀，伯樂 Aminex HPX-87H色譜柱（300×7.8 mm，9 μm），流動相為 5 mmol/L 稀 H2SO4，進樣量 10 μL，流速為0.6 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，柱溫為40℃，進樣時間為30 min。

圖1 高通量篩選流程Fig.1 Process of high throughput screening

2 結果與分析

2.1 高通量篩選結果

經過多輪易錯PCR，得到了兩株正向突變株5/13-26和7/23-6。突變株5/13-26全細胞轉化反應速率要高于對照菌13.8%（圖2（a））；用它們全細胞轉化900 mmol/L L-Ile，KMV產量分別要高于對照菌 8%，13%（圖 2（b））。 對突變株 5/13-26、7/23-6的外源L-氨基酸脫氨酶基因測序后，分析其氨基酸序列，并與親本脫氨酶的氨基酸序列進行對比，結果如表2所示，可以發現突變酶7/23-6比5/13-26僅多了一個氨基酸突變位點A209E。

圖2 突變株初始全細胞轉化反應速率及全細胞轉化900 mmol/L L-Ile KMV產量比較Fig.2 comparison of the original whole-cell biocatalyst reaction rates between mutantstrains and comparison of KMV production between mutant strains under 900 mmol/L L-Ile

表2 正向突變株外源氨基酸脫氨酶氨基酸突變位點Table 2 Amino acid mutation sites of exogenous amino acid deaminases from mutant strains

2.2 突變株全細胞轉化反應條件優化

2.2.1 突變株全細胞催化劑最適pH 如圖3（a）所示，突變株5/13-26和7/23-6最適反應pH均為8.5，且在pH 8.0～9.0范圍內，突變株5/13-26全細胞轉化反應速率高于對照菌。不同pH下突變株全細胞催化劑的相對活性變化情況如圖3（b）所示，可以發現，當pH為7.5時突變株5/13-26活性下降幅度最大，約34%。而在實際的全細胞轉化過程中，由于大量KMV生成，緩沖液pH值會由最初的8.5逐步下降為7.3左右。所以，突變株5/13-26的L-氨基酸脫氨酶可能對反應pH值變化較為敏感，酶活性也因此受到影響。

圖3 反應pH對全細胞轉化反應的影響Fig.3 Effect of pH on whole-cell biocatalyst

2.2.2 突變株全細胞催化劑最適反應溫度 在20～37℃范圍內，設置4個溫度梯度，測定全細胞轉化反應進行24 h后的KMV產量，結果如圖4所示。可以發現，突變株5/13-26和7/23-6全細胞催化劑最適反應溫度為30℃。當全細胞轉化溫度為37℃時，突變株5/13-26全細胞催化劑的KMV產量下降幅度最大，這可能與突變株5/13-26的外源L-氨基酸脫氨酶熱穩定性有關。

2.2.3 突變株全細胞催化劑最適反應時間 以900 mmol/L L-Ile為底物，以pH 8.5 Tris-HCl為緩沖液，使用1 g/L細胞量（DCW），在30°C下進行全細胞轉化反應，測定12～24 h內不同菌株全細胞催化反應中KMV產量隨時間的變化情況，結果如圖5所示，可以發現，突變株5/13-26和7/23-6全細胞催化反應在轉化反應進行24 h后KMV達到最大值，對照株在21 h時達到最大值。在轉化反應進行至21 h之后，KMV產量增加幅度在逐步降低，這說明在轉化反應后期，全細胞催化劑的酶催化活性已經大幅度降低。

圖4 反應溫度對全細胞轉化反應的影響Fig.4 Effect of reaction tempreture on whole-cell biocatalyst

圖5 轉化反應時間對全細胞轉化反應的影響Fig.5 Effect of reaction time on whole-cell biocatalyst

2.2.4 突變株全細胞催化劑最適底物濃度 在600～1 200 mmol/L L-Ile范圍內設置了5個濃度梯度，測定全細胞轉化反應進行21～24 h后的最大的KMV產量，可以發現突變株5/13-26和7/23-6最適底物濃度均為900 mmol/L L-Ile，而初始菌最適底物濃度為 800 mmol/L L-Ile（圖 6（a）），這說明該兩株突變株全細胞轉化L-Ile的能力要強于對照菌。當繼續增加底物濃度，KMV產量反而出現了下降（圖6(a)），這說明當細胞長時間暴露于高濃度的L-Ile飽和溶液中時全細胞催化劑受底物抑制的現象才顯現出來。此外，當底物濃度為600～800 mmol/L時，這三株菌全細胞轉化反應時底物轉化率均在90%以上，繼續增加底物濃度時，底物轉化率均急劇下降（圖6(b)）。盡管如此，在900 mmol/L L-Ile下，突變株7/23-6的KMV產量可以達到102 g/L，底物轉化率可以達到87%，與對照菌相比，底物轉化率提高了13%。

圖6 比較突變株5/13-26、7/23-6與初始菌全細胞轉化不同濃度L-IleFig.6 Comparison of whole-cell biocatalysts between 5/13-26，7/23-6 and the original strain under different L-Ile concentration

綜上所述，1 g/L突變株全細胞催化劑（DCW）全細胞轉化反應最適轉化反應條件為：以pH 8.5 Tris-HCl為緩沖液，用900 mmol/L L-Ile作為底物，并在30℃下進行全細胞催化反應，最適反應時間為21～24 h。在此反應條件下，突變株7/23-6全細胞轉化L-Ile可生成102 g/L KMV。

2.3 產物KMV以及反應時間對突變株全細胞轉化反應的影響

2.3.1 產物KMV對突變株全細胞轉化反應速率的影響 向轉化體系中添加100 mmol/L KMV，研究KMV對不同突變株全細胞轉化反應速率的影響，并與不添加KMV時的全細胞轉化反應速率進行比較（圖7（a）），可以發現，所有菌株的轉化反應速率在添加KMV后均出現了不同程度的降低，產物KMV對酶活性產生了比較明顯的抑制作用。添加KMV后速率下降百分比如圖7（b）所示，突變株5/13-26速率下降幅度最大，約32%，高于對照菌的27%。

圖7 產物KMV對全細胞轉化反應速率的影響Fig.7 Effect of KMV on whole-cell biocatalyst reaction rate

2.3.2 轉化反應時間對突變株全細胞催化劑熱穩定性的影響 將正向突變株在30℃下熱處理不同時間，測定其全細胞轉化反應速率，結果如圖8（a）所示，熱處理24 h內，突變株5/13-26的反應速率均高于對照菌，然而其相對活性下降幅度最大（圖8（b）），約 25%；雖然熱處理 24 h 內，突變株 7/23-6反應速率一直低于對照菌，但其相對活性下降幅度最小，約 14%（圖 8（b）），低于對照菌 36.7%。由此可見，除了產物KMV對酶活性有明顯的抑制作用外，氨基酸脫氨酶的熱穩定性是另外一個不可忽略的影響因素。

3 結 語

L-氨基酸脫氨酶活性的測定，可以通過對酶催化產物組分如氨氣[18]、α-酮酸[19]進行測定，也可以用經典瓦氏呼吸器或者氧電極測定氧氣的消耗[20]，或者測定底物氨基酸的消耗量來進行酶活性測定[21]，但這些測量方式各有自己的優勢和弊端。本研究使用氯化鐵檢測酮酸，氯化鐵可以與α-酮-β-甲基正戊酸生成墨綠色絡合物，操作簡便，可以作為初篩中檢測L-氨基酸脫氨酶的檢測劑，但是由于生成的絡合物不穩定，無法在絡合物紫外吸光值和KMV濃度之間獲得較好的線性關系，所以只能采用HPLC方法對KMV進行定量檢測。盡管用定向進化等突變方法對目標基因進行突變十分普遍，但是高效篩選目標酶的方法并沒有得到改善。本研究中使用的高通量篩選方法具有概率低、工作強度大、消耗時間長的缺點，需要對每個克隆子進行重復操作，先后要經過96孔板培養、轉移部分菌液至另一塊96微孔板以及活性測定這些過程，面對突變子數量龐大的突變庫卻無法針對耐產物抑制突變子直接進行篩選。此外，較低濃度的KMV即可與氯化鐵絡合反應產生顏色較深的墨綠色現象，降低了篩選的靈敏度。建立一個適合在培養液中快速、靈敏檢測L-氨基酸脫氨酶的高通量篩選方法仍舊是一項挑戰[22]。

由于L-Ile在室溫下最大溶解度為30 g/L左右，一定量的固體L-Ile在轉化反應開始前被一次性加入到20 mL轉化反應體系中，然后一邊被轉化生成KMV一邊溶解。因此在實際的全細胞轉化底物過程中，底物抑制作用并不是很明顯，只有在細胞長時間暴露于L-Ile飽和溶液中時，底物的抑制作用才顯現出來。此外，產物抑制在本研究中表現得較為明顯，高濃度的KMV會抑制底物進一步被轉化為產物。由于L-氨基酸脫氨酶的活性在實際轉化反應過程中同時受產物抑制和底物抑制、環境pH值的變化和酶的熱穩定性的影響，全細胞轉化反應速率不能作為唯一的檢測指標來進行突變子篩選，所以本研究通過逐步增加底物濃度，對不同突變株全細胞轉化底物的最高KMV產量進行對比，來篩選出綜合性能提高的突變株。

雖然可以通過隨機突變的方式對L-氨基酸脫氨酶進行分子改造，但該方法具有一定盲目性。來源于蛇毒（Calloselasma rhodostoma）和不透明紅球菌（Rhodococcus opacus）中的氨基酸氧化酶的晶體結構均被報道[23-24]，并且這些酶的催化活性以及結構特點均被詳細地研究。但是L-氨基酸脫氨酶的氨基酸序列與它們的同源性不高，與其他有晶體結構報道的蛋白的氨基酸序列相似性也較低，無法開展可靠性較高的蛋白結構同源模擬。

易錯PCR具有操作簡便的特點，其應用也比較廣泛。本研究利用易錯PCR定向進化來自于Proteus mirabilis的L-氨基酸脫氨酶，獲得了全細胞轉化L-Ile生成KMV產量略有提高的突變株7/23-6，與突變株5/13-26相比，其目標基因的氨基酸序列僅多了一個突變位點A209E，而突變株7/23-6在熱穩定性上表現出一定程度的提高，所以后期將會對該位點進行飽和突變來分析該位點對酶活性的影響。同時，也可以在此基礎上針對該突變株的其他氨基酸突變位點進行分析來提高L-氨基酸脫氨酶轉化L-Ile的效率。