約氏乳酸桿菌中一種新的阿魏酸酯酶基因的克隆表達與性質研究

張 強， 白亞軍， 蔡宇杰*， 鄭曉暉

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.西北大學 生命科學學院，陜西 西安710069）

阿魏酸酯酶（Feruloyl esterases，FAEs），另一名稱是肉桂酸酯酶，它屬于羧酸酯水解酶類，通常植物細胞中的阿魏酸與多糖連接的酯鍵就是由它水解的，釋放出游離的阿魏酸。它可以裂解植物細胞壁中的酯鍵，破壞細胞壁結構，從而可以創造出更多的生物資源，因此在生物資源開發方面具有一定的應用價值。自從1987年第一次從Streptomyces olivochromogenes中發現以來，相繼已經發現有多種真菌，細菌都能分泌FAEs。目前已知的產FAEs的微生物主要有乳酸桿菌 （Lactobacilli）， 黑曲霉（Aaspergillusniger）， 鏈 霉 菌 （Streptomyces avermitilis），黃柄曲霉（Aspergillus flavipes）等[1]。 并且大部分的FAEs是從真菌中分離出來的[2]。

自1991年第一個FAEs純化以來，現如今已有30多種FAEs得到了純化[3]。純化的FAEs在分子量、等電點、最適反應條件等物理化學特性方面都各不相同[4]。有報道表明單糖和雙糖不支持微生物產FAEs，含有阿魏酸酯鍵的底物能誘導產FAEs。

植物細胞壁之所以這么堅硬，就是阿魏酸在其中起著舉足輕重的作用。它可以在半纖維素與半纖維素之間，木質素與木質素之間，半纖維素與木質素之間形成連接，形成一個網狀的骨架結構[5]。此外，釋放的阿魏酸是一種生理活性物質，對它可以進行進一步的加工處理，開發出更多的藥用或保健等經濟產品[6]。

本文從實驗室保藏菌中篩選產阿魏酸酯酶的乳酸桿菌，對其基因組序列進行對比分析。并利用大腸桿菌工程菌異源表達可能的阿魏酸酯酶基因以驗證其酶活活性，對其分離純化后，進一步研究其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌株和質粒 菌株為約氏乳酸桿菌株，Lactobacillus johnsoniiNBC455（由江南大學食品學院陳衛課題組惠贈）。大腸桿菌E.coliBL21（DE3）、E.coliDH5α、質粒 pColdⅡ。

1.1.2 培養基 LB液體培養基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 10，pH 7.0～7.4，115 ℃滅菌 20 min，LB平板需添加額外2%的瓊脂。

LB-氨芐青霉素（Amp）培養基（g/L）：LB 培養基滅菌冷卻至40～50℃后加入Amp，終質量濃度為0.1 mg/L。

1.1.3 主要試劑 基因工程操作用酶，包括限制性內切酶 （XbaⅠ、BamHⅠ）、T4DNA 連接酶、DNA 聚合酶、核酸電泳DNA marker、核酸電泳 Loading Buffer、標準分子量蛋白購于大連TaKaRa公司；氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖（IPTG）、引物、柱式細菌DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、質粒小量純化試劑盒Plasmid Purification Kit均從上海生工購買；其余試劑均為國產分析純。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；立式自動壓力蒸汽滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司）；高壓細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；HYL-C組合式搖床（太倉市強樂實驗設備有限公司）；DYY-8C型電泳儀 （北京市六一儀器廠）；臺式高速冷凍離心機（TGL-16M湘儀）；AKTA avant蛋白純化系統（美國通用公司）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad）；PCR 儀（美國 Applied Biosystems）；高效液相色譜PerkinElmer Series225（廣東省設備廠）；掃描型紫外可見分光光度計 UV－3900（日本日立）。

1.2 方法

1.2.1 約氏乳酸桿菌總DNA的提取 （1）在3 mL LB培養基中加3 μL氨芐青霉素，加3 μL甘油管中的菌液，37℃培養 12 h。（2）取2 mL菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清。（3）按柱式細菌DNAout試劑盒的方法提取基因組DNA，保存在-20℃冰箱中。（4）通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質量和純度，用紫外分光光度計測定其濃度大小。

1.2.2 設計引物及PCR擴增 通過序列比對，根據保守氨基酸序列，設計引物，劃線處的兩個酶切位點分別為SacⅠ和XbaⅠ。

引 物 1：5'GCCGGAGCTCATGAGAACTGGTAC TAAAATTATTA 3'

引 物 2：5'GCCGTCTAGACTATTCACCTTTAAA CCTACCA 3'

以Lactobacillus johnsoniiNBC455基因組DNA為模板進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收，電泳驗證一條帶。

1.2.3 PCR產物及質粒的雙酶切和連接 將質粒和PCR產物進行雙酶切。質粒酶切體系：10×cut buffer 5 μL，質粒 10 μL，SacⅠ和 XbaⅠ各 0.5 μL，無菌水 34 μL 共 50 μL。 PCR 產物酶切體系：10×cut buffer 3 μL，DNA 4 μL，NdeⅠ和XbaⅠ各 0.5μL，無菌水 2 μL 共 30 μL。 37 ℃水浴中切 1 h。將DNA片段克隆到pCold-ⅡVector上，并轉化到E.coli DH5α感受態細胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5 μL，DNA 片段 8 μL，載體 DNA 2 μL，T4DNA ligase 1 μL，無菌水 11.5 μL 共 25 μL。16 ℃水浴下連接12～16 h。

1.2.4 制備大腸桿菌感受態 （1）接種E.coli DH5α和 BL21（DE3）分別于含有20 mL LB培養基的250 mL搖瓶中，37℃、200 r/min培養過夜。（2）按1%接種量接種于50 mL LB培養基中，37℃培養至 OD600約 0.6（約 2～3 h）。（3）將菌液轉移到 50 mL預冷的離心管中，冰上放置30 min，8 000 r/min、4℃離心 5 min。（4）棄上清，加入 5 mL預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20 min，8 000 r/min、4 ℃離心 5 min。重復 2次。（5）棄上清，加入1.5 mL預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，含有15%的甘油，輕輕懸浮菌體，然后100 μL分裝到1.5 mL離心管中，-70℃冰箱保藏備用。

1.2.5 重組大腸桿菌的誘導表達 （1）重組質粒導入BL2L大腸桿菌感受態中。（2）加入1 mL不含抗生素的LB培養液，37℃搖1 h使菌復蘇。（3）取50 μL涂布在含氨芐的LB瓊脂平板培養基上。（4）37℃培養12 h左右。（5）挑平板上菌接到小試管37℃培養過夜。（6）部分保存甘油管，加500 μL到50 mL搖瓶，之前加50 μL氨芐。37℃培養2.5 h，15℃下靜置0.5 h，在超凈工作臺中加20 μL的IPTG。15℃下培養24 h（搖床均設置為250 r/min）。空載體轉化的BL21同時誘導表達。（7）離心收集菌體（8 000 r/min，5 min），20 mmol緩沖液復溶。

1.2.6 SDS-PAGE及蛋白含量的檢測 （1）SDSPAGE凝膠電泳。根據Laemmli[7]方法，在1 mL小試管中加入10 μL上樣buffer，加40 μL細胞破碎上清液，煮沸10 min。同時空質粒表達的也要進行電泳檢測。用12%的分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以用來初步判定蛋白表達情況和后面純化分離情況。（2）蛋白濃度檢測。根據Bradford考馬斯亮藍法[8]，以牛血清蛋白為標準蛋白測定標準曲線，測定蛋白濃度。取0.1 mL酶液，0.9 mL蒸餾水，加5 mL考馬斯亮藍試劑盒染液，反應5 min后測定OD595的吸光值。同時測定純酶的蛋白濃度。

1.2.7 酶活測定方法 酶活測定方法為：4 mL反應體系，包含 3 mL 磷酸緩沖液（0.02 mol/L，pH 6.0），0.5 mL底物溶液（4 mg/mL），0.5 mL酶液，35℃反應4 h，高溫100℃加熱終止反應，以緩沖液替換酶液作為對照反應。用高效液相色譜[9]檢測底物和產物的含量。高效液相色譜檢測條件為：0～15 min為10%乙腈，90%水 （0.1%甲酸）；15～20 min為100%乙腈，0%水；20～30 min為 10%乙腈，90%水（0.1%甲酸）。定義酶活力：每分鐘氧化1 μmol底物為產物所需的酶量為一個酶活力單位。

1.2.8 重組蛋白的初步分離純化 得到的粗酶液用AKTA avant蛋白純化儀[10]進行鎳柱純化，將A1、A2、B1、B2四根管路都放進水里，設置system flow 20 mL/min流速，進行排氣。之后把A1放進結合液中，B1放進洗脫液中，再進行排氣一次，然后設置system flow 1 mL/min、flow path（column position 3）、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0，inset A1平衡10 min后裝柱子。然后上樣粗酶液，用500 mmol/L的高濃度咪唑緩沖液B1洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來，收集有酶活的洗脫液用超濾管（30 kDa）進行濃縮。SDS-PAGE驗證純化后蛋白條帶是否單一。

1.2.9 酶學性質 （1）最適溫度分析。以阿魏酸甲酯為底物研究溫度對本發明所述酯酶酶活的影響，將酯酶分別在20～70℃下測定其酶活，將酯酶置于40、50、60與70℃下處理3 h，分別測定剩余酶活。（2）最適pH分析。以阿魏酸甲酯為底物研究pH對本發明所述酯酶酶活的影響，將酯酶分別置于pH值為3～9的緩沖液中處理96 h，測定剩余酶活。（3）反應動力學常數的測定。加相同量的酶液到不同底物濃度的反應液中，在最適溫度和pH下測定酶活，使用Lineweaver-Burk[11]雙倒數法做曲線計算Km和Vmax。

2 結果與分析

2.1 基因的克隆

通過序列比對，根據保守氨基酸序列，預測一段酯酶基因命名Lj0900，利用PCR技術成功擴增，將質粒pColdⅡ和經割膠回收的PCR目的片段進行雙酶切，酶切后在16℃條件下過夜連接。之后把連接產物導入E.coli DH5α感受態細胞中，挑取形態較好的單菌落進行菌落PCR后對其結果呈陽性克隆的轉化子接種到含Amp的LB小試管中培養過夜，提取重組質粒送往上海桑尼測序，測序結果與預期的目的基因序列一致，說明重組質粒構建成功。雙酶切結果見圖1。

圖1 重組質粒雙酶切圖Fig.1 Result of use enzyme to cut recombinant plasmid

測序結果如圖2所示。

圖2 重組基因測序Fig.2 Recombinant gene sequence

2.2 重組質粒的表達及純化

按照1.2.5節方法對重組大腸和空質粒大腸進行誘導表達，培養24 h后，對表達后的菌體破碎，對上清液進行SDS-PAGE驗證和酶活驗證。對比發現重組大腸酶量得到很好的表達，并且按照1.2.7節方法，測定重組菌具有阿魏酸酯酶活性，而空質粒菌沒有發現酶活。按照1.2.8節方法，重組蛋白經HisTrapHP組氨酸標記親和層析柱純化，收集峰位置的蛋白，進行SDS-PAGE驗證和酶活驗證，結果顯示收集峰位置的蛋白具有阿魏酸酯酶的活性，并且呈單一的條帶，達到了下一步實驗的要求。表達及純化結果如圖3所示。

圖3 SDS-PAGE驗證酶的誘導表達和純化Fig.3 To verify the result of induced expression and purification by using SDS-PAGE

2.3 酶學性質測定

2.3.1 最適溫度的測定 不同溫度下，阿魏酸酯酶的火力會有很大的影響，在以阿魏酸甲酯為底物時測定該酶在 20、30、40、50、60、70 ℃下的酶活，以最高酶活為100%計算相對酶活。從圖4中可以看出其最適溫度為30℃，在低溫下呈上升趨勢，但超過40℃時酶活急劇下降，其與方園等人[12]研究的最適溫度25℃也相差無幾。

圖4 酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of enzyme

2.3.2 最適pH的測定pH對酶催化反應的影響也很大，pH過大（偏堿）或過小（偏酸）都會使酶失活。pH的改變能影響酶活性中心上必須基團的解離程度，同時影響底物與輔酶的解離程度，從而影響酶分子與底物分子的結合和催化。在以阿魏酸甲酯為底物時測定該酶在 pH 為 3、4、5、6、7、8、9 時的活性，發現在低pH下，pH越大，活性越高，在pH超過6時，活性開始下降，中性條件下活性比較高。其最適pH為6。其最適pH與方園等人[12]研究的阿魏酸酯酶基本一致。結果如圖5所示。

圖5 酶的最適pHFig.5 Optimum pH of enzyme

2.3.3 酶的反應動力學常數 Km是極為重要的反應動力學參數，1/Km表示酶分子與底物之間親和力的大小。1/Km值越大，酶與底物的親和力越大。kcat/Km大小反映酶對底物的催化能力，值越高說明催化效率越高。分別以阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、綠原酸、咖啡酸乙酯、對羥基肉桂酸甲酯為底物，測定該酶的Km及kcat/Km值，如表1所示。發現以綠原酸為底物時，Km值最小，且催化效率最高，kcat/Km達到1.13×103L/（mol·s）。在以阿魏酸甲酯為底物時，其kcat/Km值高于 Topakas等[13]研究的 2.79×102L/（mol·s），但低于 Rumbold 等人[14]的 3×105L/（mol·s）。 在以綠原酸為底物時，發現其kcat/Km小于Lai等人[15]研究的數值。

表1 反應動力學參數Table 1 Kinetics parameters

3 結 語

龔燕燕等人[16]從寧佐美曲美中克隆了編碼阿魏酸酯酶A的基因，并成功在畢赤酵母中得到了異源表達。先前的研究已經在約氏乳酸桿菌中發現兩個阿魏酸酯酶[15]，本文根據菌株的全基因組序列和阿魏酸酯酶的保守序列又發現了一個新的阿魏酸酯酶，是約氏乳酸桿菌桿菌中第三個阿魏酸酯酶。對其成功克隆表達，并具有較高的活性，對其酶學性質進行了初步的研究，發現其最適溫度為30℃，最適pH為6。新發現的阿魏酸酯酶為后人進一步研究阿魏酸酯酶奠定了一定的基礎。現在隨著分子技術的日益成熟，為FAEs找到更好的受體菌，從而實現更高效、高量的表達奠定了一定的基礎。但是，不同菌株來源的FAEs在性質、作用等方面還是參差不齊的，況且這種酶主要是應用于醫藥、化妝品、食品等行業，更要對其安全性要求高，對此，尤其還要研究該酶的微生物安全性。所以說要實現工業化生產還是很難的。另一方面還可以結合微生物信息學研究其基因與酶學性質的關系。總而言之，阿魏酸酯酶具有廣泛的應用前景，但距離實際的工業化生產還有不少的路要走，仍需要對其進行更深的研究。