大鼠脊髓突觸體中生理活性物質分析①

劉正，袁文華，趙舒煊，沈偉，馮曉飛，周海宇

1.蘭州大學第二醫院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，甘肅蘭州市730030

突觸是神經元相互接觸的部位，是神經元之間在功能上發生聯系的部位，也是信息傳遞的關鍵部位。突觸體最早由Whittaker等命名[1]，是指具有突觸區完整形態結構的封閉顆粒[2]，某種意義上可被認為是具有功能完整的活細胞[3]，但與細胞又有很大區別。

中樞神經系統典型突觸前神經末梢具有100~200個神經遞質填充的突觸小泡，在動作電位刺激下以Ca2+依賴性方式將其內容物釋放到突觸間隙中[4]。本研究對大鼠脊髓突觸體中生理活性物質進行分析測定，為探究相關疾病的機制提供方法學基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性Sprague-Dawley大鼠，標準體質量，由蘭州大學醫學院實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號SCXY(甘)2009-0004，使用許可證號SYXK(甘)2009-0005。

1.2 主要儀器與設備

1260高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse-AAA色譜柱(4.6×150 mm,5 μm)：美國AGILENTTECHNOLOGIES公司。BP1215分析天平：德國SARTORIUS公司。Heal Force NW超純水機系統：上海力新儀器有限公司。3K15、3-30k離心機：北京五洲東方科技發展有限公司。U-3900H紫外分光光度計、U-3900H熒光分光光度計：日本日立公司。

1.3 主要試劑及其配制

Percoll分層液：美國GE HEALTHCARE公司。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、10×PBS(NaCl 40.0 g、KCl 1.0 g、KH2PO41.0 g、Na2HPO4·12H2O 10.4 g)、TritonX-100、乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸EGTA：北京索萊寶科技有限公司，純度≥99%。OPA衍生劑、硼酸鹽緩沖液：美國AGILENTTECHNOLOGIES公司。甲醇、乙腈(色譜純)：天津市光復科技發展有限公司。Na2HPO4·10H2O(優級純)、蔗糖緩沖液(0.32 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA、5 mmol/L Tris，pH=7.4)、人工腦脊液：上海源葉生物科技有限公司。戊二醛：上海生工生物有限公司。超微量ATP酶測試盒(Na+-K+、Ca2+-Mg2+、總ATP酶)、ATP測試盒：南京建成生物工程研究所。Ca2+熒光探針Fluo-3AM(5 mM)：上海碧云天生物技術有限公司。

流動相A：Na2HPO4·10H2O 14.32 g加水1 L，鹽酸調pH=7.8。流動相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10(體積比)。

氨基酸標準品配制：分析天平準確量取一定質量氨基酸標準品，溶于超純水中配制1 nmol/L氨基酸標準品溶液，4℃保存，使用時稀釋至不同濃度。

1.4 樣品提取

雌性Sprague-Dawley大鼠斷頭處死，冰袋上迅速取出頸髓至腰髓全部脊髓組織，4℃蔗糖緩沖液中洗滌2~3次，盡可能剝除脊髓膜；用預冷的濾紙吸干表面水分，稱重后放入預冷的玻璃勻漿管中，按質量體積比1∶10加入蔗糖緩沖液，勻漿6~10次。勻漿液3600 r/min 4℃離心10 min，取上清液；上清液2 ml平鋪于3%Percoll蔗糖梯度層，20,000 r/min 4℃離心5 min，取第三、四層分界處懸液。懸液1∶5(體積比)加入蔗糖緩沖液稀釋，置10 ml離心管中，15,000 r/min離心20 min，沉淀即為脊髓突觸體。置預先持續通以 O2、CO2(體積比 95∶5)30 min，并在 5%CO2細胞培養箱37℃預培養30 min的適量人工腦脊液中，混勻。

1.5 氨基酸神經遞質測定

人工腦脊液中脊髓突觸體分成3份，置24孔板的3個孔中，5%CO2細胞培養箱中37℃培養15 min。

第1份加適量人工腦脊液后，超聲細胞破碎儀破碎(超聲破碎組)，工作參數：50 W，工作5 s，暫停10 s，共15次。破碎時試管應完全浸入冰水浴，防止高溫造成突觸體碳化。破碎后，12,000 r/min 4℃離心20 min，取上清液-70℃保存。

第2份加等體積終濃度50 mmol/ml KCl溶液(KCl刺激組)，繼續反應30 min，迅速置于冰水浴中，12,000 r/min 4℃離心20 min，取上清液于-70℃保存。

第3份加入等體積人工腦脊液，其余處理同第2份(正常溫育組)。

高效液相色譜儀測定3份上清液中谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、GABA的含量。上樣前平衡色譜柱，待柱溫箱溫度適宜，色譜波穩定后上樣。

1.6 ATP和ATP酶測定

脊髓突觸體混懸液15,000 r/min離心10 min，取下層沉淀，加入熱雙蒸水500μl，100℃熱水浴破碎；懸液于沸水浴中加熱10 min，混勻抽提1 min。所得樣本用于ATP含量測定。

取適量脊髓突觸體混懸液離心后取下層沉淀，加生理鹽水500μl混勻，超聲細胞破碎儀破碎。所得樣本用于ATP酶活性測定。

紫外分光光度計，測定波長636 nm，光徑1 cm，雙蒸水調零。

1.7 Ca2+測定

用人工腦脊液(純氧負載1 h)將混勻的脊髓突觸體平均分成2份，置24孔板2個孔中，5%CO2細胞培養箱37℃培養15 min。一份加終濃度50 mmol/L KCl(KCl處理組)，另一份加等量生理鹽水(生理鹽水組)，然后兩份各加入等量0.25 mmol/L Fluo-3AM，使終濃度為0.5μmol/L，繼續于細胞培養箱中避光溫育30 min。熒光探針裝載，15,000 r/min離心10 min，共2次。去上清液，加等量人工腦脊液重懸。熒光分光光度計檢測，激發波長506 nm，發射波長525 nm，測定吸光度值F；加入4%TritonX-100，使終濃度為0.1%，避光混勻10 min，測定最大吸光度值Fmax；加入EGTA使終濃度為5 mmol/L，避光混勻10 min，測定最小吸光度值Fmin。計算細胞內Ca2+濃度([Ca2+]i)[5]：

1.8 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。數據以(xˉ±s)表示，多組間比較采用方差分析。標準品濃度梯度采用線性回歸分析，建立標準曲線。

2 結果

2.1 氨基酸神經遞質

各氨基酸標準品溶液稀釋至10 pmol/ml，高效液相色譜儀色譜圖見圖1。

大鼠脊髓突觸體懸液用高效液相色譜儀檢測，結果見圖2。在8.7 min左右分離出一個色譜峰⑤，排除相近氨基酸后，無對應標準品對照，無法進行檢測。

根據樣本所得峰面積計算樣本氨基酸濃度，再根據樣本的蛋白濃度(1.873 g/ml)轉化為pmol/mg蛋白質。與正常溫育組相比，KCl刺激組天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、GABA增加(P<0.05)。超聲破碎組由于含量低于氨基酸標樣范圍(4.5~450 pmol/ml)，數據未參與統計學分析。見表1。

樣本試樣后，估計氨基酸遞質濃度，配制10 pmol/ml、 15 pmol/ml、 20 pmol/ml、 25 pmol/ml、 50 pmol/ml氨基酸標準品，得到不同濃度氨基酸標準品對應峰面積，建立線性公式。見表2。

圖1 混合氨基酸標準品的色譜圖

圖2 樣品的色譜圖

表1 各組氨基酸含量(pmol/mg)

表2 各氨基酸濃度線性公式及檢驗

2.2 ATP酶活性和ATP含量

ATP酶活性測定樣本蛋白濃度為1.099 g/L，ATP含量測定樣本蛋白濃度為1.648 g/L，標準品線性公式為Y=0.9407x+0.0938(R2=0.99)。ATP酶活性測定和結果見表3。Na+-K+-ATP酶活性高于Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

ATP含量(414.7461±3.8562)μmol/mg(n=3)。

表3 ATP酶活性結果

2.3 [Ca2+]i測定

熒光分光光度計檢測熒光光譜見圖3。樣本蛋白濃度為1.20 g/ml。各組Ca2+濃度見表4。

圖3 樣品熒光光譜

表4 各組[Ca2+]i測量結果

3 討論

本研究在大鼠脊髓突觸體中氨基酸神經遞質測定中，發現在8.7 min左右分離出一個色譜峰，該峰較高，峰面積大，但由于沒有標準品對照(已排除相近氨基酸)，未進行檢測。根據OPA衍生試劑衍生氨基酸的原理，推測這是一種含有氨基端的物質。

ATP作為生命活動能量的直接來源，可以為突觸體釋放或傳遞氨基酸遞質等短暫生理活動，以及維持完整的膜結構提供能量。組織有炎癥、損傷時，損傷周圍會釋放大量ATP[6-7]，脊髓組織同樣存在這一現象[8-9]。劉磊等[10]證實，脊髓缺血再灌注損傷時，ATP酶活性下降；陸新穎等[11]發現，脊髓運動神經元Na+-K+-ATP酶活性會在骨骼肌損傷后現迅速下降，后逐漸恢復。Na+-K+-ATP酶主要負責神經系統Na+和K+的主動轉運，以及神經元興奮性所需電化學梯度的維持和重建[12]。此外，Na+-K+-ATP酶還可能在神經元和突觸可塑性中起重要作用，酶活性降低與許多行為異常有關，包括運動改變[13]。

突觸前膜對神經遞質的釋放有Ca2+依賴性量子式囊泡釋放和Ca2+非依賴非囊泡釋放[14]。生理條件下，哺乳動物中樞神經系統重要氨基酸遞質谷氨酸和GABA主要依靠Ca2+依賴性釋放[15]；神經系統受損時，神經元缺血缺氧，ATP缺乏，細胞外K+濃度升高，興奮性氨基酸遞質釋放增加，引起相應受體門控離子通道開放，Ca2+內流入細胞，細胞內Ca2+大量增加，造成遲發性神經元損害[16]。Ca2+超載是神經系統缺血時神經元死亡的主要原因[17]。

突觸體相關實驗有助于鑒定神經遞質，典型的方法包括檢測放射性標記的神經遞質誘發釋放，包括GABA、谷氨酸、乙酰膽堿等；或通過高效液相色譜檢測內源性釋放。后來通過熒光酶聯免疫法實時檢測內源性胞吐作用，并通過熒光苯乙烯基染料的攝取實時檢測突觸囊泡內吞作用[18]。隨著用于操縱離子通道和受體的藥理學工具出現，關于突觸體的大量實驗有助于確定調節神經傳遞的主要調節信號傳導途徑。

突觸在許多神經障礙的發病機制和病理學中起著重要作用。近年來，敲除或敲入基因小鼠制備的突觸體已被用于支持突觸蛋白作用的研究[19-20]。突觸體和突觸小泡制劑也經過蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學分析[21]。蛋白質組學研究編制了神經元特異性蛋白質在突觸中的運作，強調這些蛋白質經歷大量翻譯后修飾，以響應突觸活動而發生變化[22]。

本研究建立了脊髓突觸體內物質的檢測方法，可用來研究相關致病因素與脊髓疾病的關系。脊髓突觸體模型可以研究脊髓神經元變性的機制，從而找到臨床干預點，探討更加合理的治療方式。利用藥物作用于脊髓突觸體，可探討藥物對脊髓突觸體的作用，對于驗證臨床用藥的合理性以及開發新藥都有重大意義。