TLR/MyD88/NF-κB信號通路參與不同疾病作用機制研究進展

單佳鈴，程虹毓，文 樂，鐘國躍，朱繼孝

(江西中醫藥大學1. 中藥資源與民族藥研究中心、2. 人文學院，江西 南昌 330004)

炎癥是活體組織對外界因子造成損傷所發生的防御反應，是機體自身免疫系統清除有害刺激，促進組織修復的一種復雜的保護措施。然而，不可控的慢性炎癥會對機體造成再次損傷。炎癥在多種疾病，尤其是慢性疾病的發生、發展過程中發揮著非常重要的作用，與炎癥相關的疾病譜非常廣，包括自身免疫性疾病、炎癥疾病、感染性疾病等。機體炎癥的啟動主要通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別相關分子模式，進而啟動防御機制，同時釋放炎性介質。Toll 樣受體(Toll-like receptor，TLR)是其中一種重要的炎癥識別受體，是病原相關危險因子介導過程中非常重要的分子受體，越來越多的研究顯示，TLR/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)/核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路在多種疾病發病及治療過程中發揮重要作用。本文主要對TLR/MyD88/NF-κB信號通路在不同疾病中的研究進展進行綜述，為后續研究提供參考。

1 TLR/MyD88/NF-κB信號通路的構成

1.1TLRTLR是非特異性免疫反應中的一個重要的蛋白質分子，可以識別不同的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)。TLR首次在果蠅的胚胎發育中被Hashimoto等發現。隨后，在果蠅感染真菌的實驗中，Lemaitre等發現TLR在其免疫系統中起關鍵作用，從此展開了TLR在免疫系統中的作用研究。TLR是I型跨膜蛋白受體，其由能識別受體及與其他輔助受體結合形成受體復合物的胞膜外區、含Toll-IL-1受體結構域(Toll-IL-1 receptor domain，TIR)的胞質區以及跨膜區3部分組成。目前，在人體內已知的TLR家族中，TLR1～TLR10存在基因表達，并且可以參與免疫功能的受體分子。其中，TLR4被認為是發現最早的一個受體相關蛋白。有研究表明，TLR4在酒精性肝病中發揮重要作用，參與脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的識別和傳遞細胞內的信號。

1.2MyD88MyD88是TLR/MyD88/NF-κB信號通路中一個重要的接頭蛋白分子，可以使信號向下游轉導的的一個重要節點。MyD88在多種組織細胞中均有表達，如肝、腎、脾臟、肌肉組織，以及單核細胞、胸腺細胞等。MyD88實際上是一種胞質可溶性蛋白，整個結構由3個功能區域組成，包括C-端的TIR結構域、中間域以及N端的死亡域。C-端的TIR結構域含有130個氨基酸，主要是通過與蛋白質結合，向下游傳遞信號，N-端的死亡結構域含有90個氨基酸，負責招募下游具有死亡結構域的信號分子進入下游信號轉導。有研究表明，只有當MyD88中的死亡結構域和中間域同時表達時，才能激活下游的核轉錄因子，而其他組合皆不能激活[1]。同時，MyD88在LPS活化通路中起重要作用，MyD88基因敲除的小鼠腹腔注射高劑量的LPS，該鼠可存活超過96 h，且血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-1β含量不增加，而MyD88基因未敲除的小鼠則在96 h內全部死亡。說明在MyD88基因敲除的小鼠中，LPS的誘導活性幾乎完全消失，缺乏MyD88基因的小鼠可抗LPS誘導[2]。

1.3NF-κBNF-κB是負責調節先天性和適應性免疫應答的主要轉錄因子。在機體中，NF-κB通常以p50和p60結合形成的異二聚體發揮作用，靜息狀態下，常與細胞質中3個抑制因子(IκBα、IκBβ、IκBε)中的1個結合而呈無活性的狀態存在。當存在一些炎癥因子、生長因子、趨化因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)等，可以激活NF-κB時，IκB激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK)會被NF-κB誘導激酶磷酸化，并被泛素-蛋白酶途徑降解，當NF-κB和IKK復合物解聚后，暴露出其核定位序列，從而被轉運至細胞核內，與其相關的DNA序列結合，啟動基因轉錄并釋放細胞因子。

2 TLR/MyD88/NF-κB信號通路與疾病

2.1自身免疫性疾病TLR能夠通過識別病原體相關模式，從而介導先天性免疫和適應性免疫，參與炎癥、免疫、感染、過敏等多種疾病的發生，TLR/MyD88/NF-κB是機體防御疾病的重要通路之一。如果介導的免疫反應過于強烈，則會引起機體損傷(如細胞組織損傷和功能異常)，從而導致自身免疫性疾病的產生和發展。目前認為，造成自身免疫組織損傷的機制主要包括自身抗體導致的自身免疫疾病和自身反應淋巴細胞導致的自身免疫疾病。

2.1.1系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE) SLE是一種累及多臟器的自身免疫性炎癥性結締組織疾病。一般情況下，女性的發病率比男性高，其致病因素諸多，如遺傳、環境、激素、病原體感染等。目前已發現多條信號通路與SLE的發生和發展相關，如T/B細胞抗原受體、TLR/NF-κB信號通路、JAK/STAT信號通路等，其中，TLR/NF-κB信號通路在SLE疾病中發揮重要作用。目前，關于TLR在SLE中的研究主要集中于TLR7和TLR9。一項針對非洲和歐美人群的調查發現，狼瘡患者的TLR7和TLR9水平明顯高于正常人群，并與IL-6、干擾素調節因子α(interferon regulation factor α，IRF-α)、IRF-γ)和TNF-α的表達呈正相關。TLR9主要存在于漿細胞樣樹突狀細胞(plasma cell like dendritic cells，pDCs)以及B細胞的內質網上，能激活MyD88下游的多個信號通路，主要原因是其能識別細菌和非甲基化修飾CpG的DNA序列[3]。MyD88能與轉錄因子干擾素調節因子7(interferon regulation factor 7，IRF7)結合，激活TLR9，使IFN的表達升高。有研究通過臨床檢測SLE患者TLR9、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、血小板衍生生長因子 B(platelet derived growth factor B，PDGF-B)和C3的mRNA及蛋白水平，發現SLE患者外周血中TLR9、TGF-β1和PDGF-B的水平高于正常人，且顯示初次診斷時，TLR9 mRNA明顯升高的患者短期內可能會出現不良預后，表明TLR9可能與SLE預后有一定的關聯[4]。另有研究對SLE患者外周血單個核細胞中的TLR9和NF-κB的水平進行分析，發現SLE患者TLR9水平相對于正常人明顯降低，而NF-κB水平明顯升高[5]。

2.1.2動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS) AS是一種慢性的非特異性炎性疾病，是血管壁對機體各種損傷的一種異常反應，與免疫反應介導、細胞因子失衡、炎癥因子活化等密切相關。AS是一個慢性的過程，內皮細胞功能障礙(即脂質膽固醇和其他成分沉積在內皮)是其發病始發因素。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)與AS的發病和發展有關。TLR/NF-κB信號通路是影響AS的通路之一，在其致病的過程中發揮重要作用。研究顯示，一些藥物(如他汀類藥物)能通過調節TLR4信號通路，起到治療AS的作用。TLR4信號通路被激活，產生大量來自于白介素家族的炎癥因子, 并且經證實這些炎癥因子都與AS聯系密切，能夠直接促使平滑肌細胞的增生，使冠狀動脈粥樣硬化的炎癥進程加快[6-7]?；A研究表明，被TLR4配體刺激的AS小鼠頸動脈斑塊的面積增加，炎性細胞大量聚集在不穩定斑塊纖維帽部位，提示TLR4可刺激斑塊形成，且TLR4與血管炎癥和血管重構有關，在易損斑塊的形成和發展中起促進作用[8]。此外，MyD88在AS中也發揮著重要作用，有學者發現，MyD88基因敲除的小鼠AS的進程明顯減慢，由于MyD88基因的缺乏，TLR4/MyD88信號通路被阻斷，細胞因子水平下降，能夠有效減緩AS的進程[9]。化合物丹參酮ⅡA能減緩小鼠AS的程度，使斑塊內膠原成分增加，降低脂質和泡沫細胞比例，進而達到穩定斑塊的效果；通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路，使血清低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、總膽固醇(total cholesterol，TC)水平下降；炎癥因子單核細胞趨化因子1(monocytes chemokine 1，MCP-1)、TNF-α、細胞間黏附因子1(intercellular adhesion factor 1，ICAM-1)水平下降，從而減緩巨噬細胞的炎癥反應[10]。張冰冰等[11]通過高脂飲食建立AS模型，發現中藥復方益糖康能使TNF-α、IL-1β、IL-6的表達和p38 MAPK磷酸化水平下降，表明其可能是通過抑制NF-κB和MAPK信號通路的磷酸化，達到治療AS的作用。

2.1.3類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA) RA是一種常見的自身免疫性炎癥性疾病，小關節病變是其主要病理特征，疾病至后期，甚至可引起關節畸形和功能障礙。目前，治療RA的藥物主要有非甾體類藥物、糖皮質激素、以TNF-α抑制劑為主的生物制劑和針對T細胞作用的生物制劑。研究發現，在RA的發生和發展過程中，在細胞膜表面存在的TLR2和TLR4扮演著重要的角色。巨噬細胞和成纖維細胞是RA患者的滑膜組織中最主要的細胞，而TLR4能夠介導RA的產生和發展是由于其在這兩種細胞的細胞膜表面均有表達，TLR4表達量越高，RA患者病情越嚴重[12]。因此，降低或阻斷細胞膜表面TLR4的表達，可能成為治療RA的一種方法。郝喆等[13]以41例RA患者和45例實施創傷后滑膜切除術的患者為研究對象，通過對其外周血單個核細胞(peripheral blood single nuclear cells，PBMCs)、滑膜組織及血清中成分的分析得出，患者PBMCs、滑膜組織、血清及滑膜液中IL-38水平明顯升高，且TLR4水平明顯提高；進一步對LPS或IL-38誘導的RAW246.7細胞實驗后發現，IL-38能夠抑制LPS誘導的TLR4、IL-6、IL-8及TNF-α的表達，且進一步的分析顯示, IL-38能抑制NF-κB信號途徑激活。因此，猜測IL-38可能是通過抑制NF-κB信號途徑激活，從而抑制LPS/TLR4信號誘導的炎癥因子表達。對大鼠尾根部皮下注射TLR2配體(肽聚糖)、TLR3配體(聚肌胞)、TLR4配體(LPS)，通過在體干預大鼠關節炎的研究表明，TLR2和TLR3配體有明顯加重RA病情的趨勢。有研究組在降植烷誘導的關節炎模型中發現，TLR3 mRNA在RA發病前有表達，且在疾病的急性期持續高表達[14]。目前，國內研究表明，化合物青藤堿[15]、黃芩苷[16]可有效降低大鼠RA關節滑膜的炎癥反應，減弱TLR2/TLR4、MyD88及NF-κB的表達，表明其可能通過介導TLR2/TLR4-NF-κB信號通路，減緩疾病炎癥反應的進程，從而有效的治療疾病。

2.1.4潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC) UC是一種慢性的炎癥性腸道疾病，近年來，UC的患病率逐年增加。研究認為，UC的發病受多種因素(遺傳、環境、免疫、自由基損傷等)的影響，其中免疫方面的異常和失衡被認為是發病的重要原因，而腸道內腸道菌群失調被認為是造成免疫方面異常和失衡的關鍵因素。李琳等[17]通過研究UC患者中腸道菌群的變化、細胞因子和TLRs的表達發現，UC患者腸黏膜組織中TLR2、TLR4、TLR5、TLR9的表達高于對照組，且與擬桿菌、腸桿菌、腸球菌的含量呈正比，與雙歧桿菌和乳桿菌的含量呈反比；外周血中炎性因子IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α 等高于對照組，而IL-4低于對照組。說明UC的發病與TLRs的高表達密切相關，可通過增強TLR2、 TLR4、TLR5和TLR9的表達，介導炎癥疾病的發生。焦艷芳[18]基于TLR4/MyD88/NF-kB通路，研究N-甲基野靛堿(N-methylcytisine,NMC)對小鼠UC的作用，發現NMC能夠減少結腸組織中炎癥因子(如TNF-ɑ、IL-1β、IL-6)和蛋白TLR4、MyD88、TRAF6、IκB、p-IκB、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表達，降低小鼠疾病的活動指數，以及減小結腸組織的病理損傷，對UC小鼠具有良好的保護作用。李斌等[19]通過研究烏梅丸及其拆方對大鼠UC的研究表明，烏梅丸及其拆方可以通過調節MyD88依賴途徑，影響TLR9/NF-κB p65的傳導，從而抑制下游炎癥因子的釋放及其蛋白表達，對大鼠UC發揮一定的治療作用。

2.2感染性疾病

2.2.1細菌性感染 細菌性感染是指細菌借助其表面的一些特殊成分和結構，吸附于人體皮膚黏膜(如口腔黏膜、眼瞼黏膜、鼻黏膜、尿道黏膜等)，繼而以不同的方式引發疾病，如皮膚感染、五官感染、氣管感染、泌尿系統感染等。TLRs/NF-κB信號通路在細菌性感染疾病中發揮著重要的作用，促進各種細胞因子與炎癥因子的合成與釋放是其主要功能。研究顯示，TLR4能與革蘭陰性菌結合產生LPS，TLR5能和細菌內鞭毛蛋白結合而被激活，TLR5在感染軍團桿菌的肺泡上皮細胞中起重要作用，主要依靠其能與病原菌內的鞭毛蛋白結合，刺激細胞表達 IL-8 明顯增多，并且 TLR5 能增加人體對細菌的易感性[20]。Richard等[21]通過建立小鼠肺炎雙球菌傳播的模型發現，缺乏TLR2的小鼠增加了肺炎雙球菌的傳播，且高水平定植，而在鼻內給予TLR2激動劑Pam3Cys的小鼠，其傳播效率明顯降低，說明TLR2的刺激可能限制細菌的傳播。

2.2.2真菌性感染 近年來，真菌性感染疾病的發病率不斷升高，一些嚴重的侵襲性真菌病，如念珠菌病、煙曲霉病、隱球菌病等，若不及時診治可迅速致死，已成為嚴重威脅免疫受損的患者和動物的感染性疾病之一。目前研究顯示，在已發現的13個TLRs中，在抗真菌性感染過程中，主要發揮作用的有TLR2、TLR4、TLR6、TLR7和TLR9。念珠菌屬感染是我國目前最主要的致病菌感染，其中尤以白念珠菌為主。TLR2和TLR4能夠識別白念珠菌細胞壁上的甘露聚糖或甘露聚糖蛋白質復合物，它能夠依賴這種方式激活NF-κB途徑。有研究顯示，MyD88缺陷的小鼠更容易感染白念珠菌和煙曲霉菌,這可能是由于MyD88的缺乏中斷了信號轉導通路，從而提高了抗白念珠菌和煙曲霉菌的感染性[22]。

2.2.3病毒感染 TLRs是能夠識別病毒成分的主要模式識別受體之一，可通過其識別入侵病原體的相關分子模式，使天然免疫應答被激活，并產生干擾素和炎癥因子。病毒在受感染的宿主細胞內復制，產生病毒蛋白和病毒核酸，其中存在于細胞膜表面的TLR2和TLR4能夠對病毒蛋白進行識別，激發天然免疫反應，阻斷病毒的復制，減緩感染性疾病的進程,而TLR3、TLR7/8和TLR9能夠參與不同病毒核酸的識別。有研究證明，純化的Epstein-Barr病毒(EBV)編碼的dUTPASE通過TLR2募集MyD88，激活NF-κB信號通路，促使IL-6的生成；EBV感染人單核細胞和pDCs后，通過TLR2活化NF-κB信號通路，誘導MCP-1的生成[23]。TLR2能通過識別丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白和非結構蛋白3 ，活化MAPKs和NF-κB信號通路，介導炎癥反應[24]。

3 過敏性疾病

現階段，過敏性疾病由于治療費用高昂、不良反應以及療效不明顯等因素，急需尋求安全、有效，且費用適宜的治療方法。研究顯示，TLRs在過敏性疾病中發揮作用，TLRs與Th1型和Th2型T細胞的形成和成熟密切相關。TLRs能識別引起呼吸道過敏的革蘭陰性和革蘭陽性細菌，以及一些病毒成分。研究發現，TLR2、TLR4、TLR9等與過敏性疾病密切相關[25]。TLR2的表達對過敏性氣道炎癥(如過敏性鼻炎、哮喘)等有一定的影響，TLR4可促進過敏性鼻炎的發病，TLR9則在人體組織內廣泛存在，如人類鼻竇組織細胞、肥大細胞、pDCs[25]。

4 總結與展望

TLR/MyD88/NF-κB信號通路與人機體內的各種炎癥疾病密切相關，能參與各種炎癥反應的發生和發展，在治療不同的疾病中發揮著重要的作用。TLR/MyD88/NF-κB信號通路對不同疾病的調控有著潛在的相似，大多藥物都是基于該通路，通過調節細胞因子、炎癥因子、趨化因子等的水平，改善和治療疾病。因此研究同一信號通路在不同疾病中的表達不失為一個好方向，通過研究比較其作用機制和致病機理的異同，尋找不同疾病中相同的作用靶點，為發現治療不同疾病的同一靶向制劑提供思路和依據，從而達到異病同治的目的。此外，不同的信號通路之間的聯系也十分復雜，同一疾病可能受到多個不同信號通路的調控；或者同一疾病的不同時期，不同信號通路的轉導作用強弱也不同；而目前基于一種疾病的多條信號通路研究，或者基于同一疾病不同時期的不同信號通路的作用研究也較少。因此，對其相互間關系進一步深入研究有利于我們進一步明確疾病的致病機制，了解藥物的作用機制，為進一步預防和治療疾病提供依據。但是有研究表明，活化的信號通路一方面雖能改善疾病，另一方面也能加快某些腫瘤細胞的增殖、惡化。因此，對于一個通路的激活對疾病是否有幫助值得我們進一步探索。相信隨著對信號通路(同一信號通路與不同疾病，不同信號通路與同一疾病以及不同信號通路間相互作用關系)研究的不斷深入，疾病的作用機制也將越發的明確，更有利于我們進一步的預防和治療疾病。