簡述熒光蛋白

王裕鵬

(海南省洋浦經濟開發區洋浦中學 洋浦 578000)

染色和標記是細胞生物學研究常用方法。早在熒光蛋白發現之前，免疫偶聯熒光標記、化學熒光染料直接標記等技術已廣泛應用于生物分子的研究中。而熒光蛋白的發現及后續改造，為生命科學基礎研究提供了更為完善和系統的標記工具，為探索活細胞中微觀生命的活動規律創造了機會，推動了人們對生命進一步的認識。

1 熒光蛋白的發現及分類

1.1 綠色熒光蛋白 1962年，下村修從維多利亞多管水母中分離到一種蛋白，在紫外線激發下它可以發出綠色熒光，即綠色熒光蛋白(GFP)[1]。他還采用生物化學方法初步推測了GFP的發光位點和發光基團[2]。普拉舍于1985至1992年間完成了GFP基因和蛋白質序列的測定，并確定了發光位點[3]。隨后科學家解析了GFP的晶體結構[4]。首次將GFP應用于生物學研究的是馬丁·查爾菲，他通過分子生物學技術將GFP的cDNA在線蟲等模式生物中表達[5]，使人們意識到GFP作為報告基因的巨大潛力。錢永健團隊解析了GFP的發光機制[6]，并通過突變對GFP改造，得到了一些熒光亮度更高、吸收峰單一、構象折疊效率高的突變體，如GFP-S65T[7]。為了表彰他們在綠色熒光蛋白研究中做出的巨大貢獻，2008年諾貝爾化學獎授予了下村修、馬丁·查爾菲和錢永健三位科學家。

1.2 紅色熒光蛋白 1999年，Matz等從珊瑚蟲中分離出了能在紫外照射下發出紅色熒光的蛋白質——紅色熒光蛋白(RFP)[8]。其中，DsRed是最早用于研究的紅色熒光蛋白，2001年Yarbrough等人解析了它的晶體結構[9]。相比于GFP，它有更高的熒光強度，成像背景低，并能激發和發射更長的波長。很多時候，研究者可同時使用GFP和DsRed對不同蛋白質進行雙標記可完成GFP無法獨自解決的問題。但DsRed在應用中也因成環氧化過程緩慢、易寡聚化等缺陷，限制了其在一些研究中的應用。隨后科研人員對其進行一系列的遺傳改造，使其成為真正意義上的RFP。

1.3 其他類型的熒光蛋白 為了擴大熒光蛋白的用途，科研人員基于光譜特性作了進一步的改造，得到了不同顏色的突變體。例如，突變GFP獲得了藍色(BFP)、青色(CFP)、綠色(GFP)和黃綠色(YFP)四組不同顏色的熒光蛋白，其光譜范圍覆蓋藍色至黃色[10]。RFP突變衍生出了橙色、紅色和近紅外光譜的熒光蛋白。以上變種的光譜幾乎覆蓋了可見光范圍，極大地提高了熒光蛋白標記選擇的靈活性。此外，隨著人們對熒光蛋白的不斷研究，科研人員又從其他物種分離了各種熒光蛋白，發現它們會因物種的不同在結構、性質和發光機制上也有所差異。

2 熒光蛋白的理化性質

GFP是由238個氨基酸組成的分子量約為27 kD的單體蛋白。其二級結構是11條β折疊鏈組成的圓柱體狀，還有一條α螺旋鏈沿圓柱體中軸分布，我們稱之為β罐[4]。GFP能產生熒光是因為內部的絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸(第65～67位氨基酸殘基)形成了生色團，該生色團位于圓柱體中心的α螺旋上，為自己創造了一個穩定的環境。生色團內的分子可環化形成對羥基亞芐基-咪唑啉酮，這種化學鍵能被激發發光[3]。該過程是自動催化完成的，不需要底物和其他蛋白質的修飾，唯一需要氧氣作為輔助因子參與化學鍵形成時的脫氫反應[4，6]。

DsRed是由225個氨基酸組成，分子量約為26 kD的蛋白質。與GFP相比，兩者在一級結構上同源性很低，但二級結構的相似度很高，也能形成β罐[9]。其生色團是由谷氨酰胺—酪氨酸—甘氨酸(第66～68位氨基酸殘基)組成。生色團的形成兩者也有差異，DsRed會先形成類似于GFP的生色團中間體，再經氧化反應，才轉為紅色熒光生色團[11]。總的來看，DsRed的生色團是GFP生色團的延伸。

3 熒光蛋白的應用

由于熒光蛋白的眾多優點，使其廣泛應用于生物學的多個領域。

3.1 蛋白質定位和功能研究中的應用 熒光標記和示蹤是熒光蛋白最基本的功能，也是目前細胞生物學研究的重要手段。例如，研究一種蛋白質在細胞中的分布時，可將目的蛋白基因和熒光蛋白基因融合到同一質粒中，構建融合基因表達載體，并轉染至細胞內，表達的融合蛋白能行使目的蛋白的生物學功能，又有熒光蛋白的發光特點。隨后借助激光共聚焦顯微鏡分析目的蛋白的亞細胞定位。此外，上述融合表達載體還可用于啟動子分析、基因表達調控等的研究。

3.2 蛋白質互作研究中的應用 蛋白質互作是生命現象發生的基礎，研究其互作可以闡明生物反應的機理，揭示生命現象的本質。目前，基于熒光蛋白的熒光共振能量轉移(FRET)技術和熒光互補(FC)技術已成為研究蛋白互作的有效手段。以FRET技術為例，FRET現象涉及兩種熒光蛋白，分別作供體和受體，要求供體的發射譜與受體的吸收譜重疊，當兩者距離很近時(1～10 nm)，光子能量將從供體轉移至受體，使受體發出熒光。目前，最常用的一對供受體是基于GFP突變的青色熒光蛋白(CFP)和黃色熒光蛋白(YFP)。例如，研究a、b兩種蛋白質間是否互作，就可以將CFP基因和YFP基因分別與編碼a、b蛋白的基因融合到同一質粒，并在同一細胞中表達。如果a、 b蛋白發生互作，CFP和YFP也會因a、b蛋白構象的改變而靠得很近，從而發生FRET現象。此時就能檢測到YFP發射的熒光，而CFP發射的熒光會大大減弱甚至消失。