體細胞克隆猴誕生引發的思考

顏 婷 黃 浩

(福建師范大學生命科學學院/福建師范大學國家級生物學實驗教學示范中心 福州 350117)

2017年11月27日，世界上首例體細胞克隆猴“中中”在中國科學院神經科學研究所誕生；12月5日第二只克隆猴“華華”誕生[1]，這一舉世矚目的成果標志著人們成功攻克克隆靈長類動物的世界性難題，確立了我國在非人靈長類研究領域的領先優勢。本文對動物克隆的研究歷程、研究現狀以及克隆猴誕生對生命科學、臨床醫學和社會倫理學的影響進行概述。

1 動物克隆的歷史回顧

“克隆”一詞是英語“clone”的音譯，究其詞源，是植物學家借由希臘語“細枝”(klon)衍生而來，用于表示植物的“無性繁殖”。后來“克隆”就成為一種利用生物學手段實現“無性繁殖”的技術總稱。高等動物能否像植物那樣進行克隆呢？長期以來科學家一直進行著不懈的研究。1935年,Spemann[2]設計了一個精巧的實驗： 先用嬰兒頭發絲將蠑螈(Cynops)受精卵環縊結扎為帶核側(有細胞核)和無核側(無細胞核)兩部分，結果發現只有帶核側受精卵能夠正常發育形成胚胎，而無核側受精卵則發育停滯；如果將經過幾次分裂的細胞核重新推到無核側，則該側受精卵又重新開始分裂并能發育成個體，且該個體比原先帶核側受精卵發育的個體更為“年輕”。這一實驗結果證明了：“經過若干次分裂并初步分化的動物細胞核仍然具有發育成完整個體的能力”，也就是后來學術界普遍接受的“體細胞核具有全能性”觀點的雛形。Spemann借此發現獲得諾貝爾獎，人類由此開啟了脊椎動物體細胞克隆技術的新時代。

1952年，Briggs和King[3]將黑斑蛙(Rananigromaculata)囊胚期細胞的細胞核移植到去核卵細胞,成功獲得正常發育的蝌蚪,這是首次核移植動物克隆試驗。1973年，我國生物學家童第周[4]成功得到克隆魚(Piscium)。

然而這些動物都是體外受精和體外發育的，而哺乳動物多數是體內受精，且胚胎發育是在母體子宮中進行的，這大大增加了哺乳動物克隆研究的難度。上世紀80年代，科學家以小鼠正常囊胚的內細胞團細胞為核供體，移植并重構胚胎，在體外發育至桑葚胚或囊胚期后移植至代孕母鼠子宮，最終獲得發育正常的幼鼠。此后，以胚胎細胞克隆技術為基礎的動物，如山羊、牛、豬、兔和大鼠陸續克隆成功。我國科學家也在90年代相繼得到類似的克隆哺乳動物。

1996年，Campbell和Wilmut[5]利用6歲成年綿羊乳腺上皮細胞成功得到第一只體細胞克隆哺乳動物—“多莉(Dolly)”。“多莉”羊的誕生證明了已經高度分化的成年動物的體細胞可以在適當條件下去分化，重編程后恢復其全能性。之后，科學家相繼克隆出牛、小鼠和貓等20多種哺乳動物。1999年，我國科學家陳大元等[6]將成年大熊貓體細胞的細胞核作為供體，移植到去核兔卵母細胞中構建異種重構胚，體外培養獲得孵化囊胚。這項研究成果被評為當年中國十大科技進展之一。

盡管科學家對非人靈長類動物的研究嘗試早在“多莉”羊之前就已經開始，但是隨著動物進化的等級升高，靈長類動物因其性成熟和妊娠期都相對較長，且生命維持機制非常復雜，克隆實驗實施異常困難。

2 體細胞克隆猴的誕生

2002年，Mitalipov等以恒河猴的體細胞作為核供體進行核移植獲得胚胎，再移入3只受體，盡管最終沒有一只能懷孕，但這是人類首次利用非人靈長類動物體細胞開展體細胞核移植克隆研究。但之后的許多克隆研究都屢屢失敗，最接近成功的一次是已經得到轉入胚胎發育且能檢測到心跳的克隆恒河猴胚胎，在妊娠81天以流產告終。

為什么靈長類體細胞克隆這么難呢？主要原因有： ①靈長類卵母細胞不透明，造成去核難度大；②靈長類卵母細胞敏感，極易提前激活，影響融合率；③體細胞細胞核在受體卵母細胞中重編程不完全，導致胚胎發育率低下。

中國科學院孫強團隊針對這些困擾因素進行了針對性的技術優化： 首先，利用偏振光給卵母細胞“打光”，解決了卵母細胞不透明影響細胞核示蹤的問題，并快速高效地完成去核操作，保持其活性；然后取來自幼猴纖維組織細胞，以HVJ-E病毒處理，采用壓電驅動的顯微操作方法注入去核卵母細胞并介導融合，既降低了卵母細胞的敏感性，又避免了對卵母細胞的擠壓，減少細胞損傷；重組胚胎融合后1 h將其激活，將Kdm4d和TSA以合適配比注入激活后的胚胎，并培養一段時間，顯著提高克隆囊胚的發育率。終于成功獲得體細胞克隆食蟹猴——“中中”和“華華”[1]。

3 克隆猴帶來的思考

體細胞克隆猴的誕生不僅證明了靈長類克隆的可能性，也為探索建立更接近人類的醫學動物模型提供了新途徑。目前，醫學基礎研究廣泛采用小鼠模型，但這些研究成果卻因為物種差異而不能簡單平行遷移到人體水平直接應用。因此，在藥物研發、藥效評估等生物醫學研究中還需使用實驗猴，而體細胞克隆猴將能在一定程度上減少使用自然繁育實驗動物。由于體細胞克隆猴基因背景近乎一致，解決了以往實驗中靈長類動物個體差異大、實驗可重復性差等問題。

克隆猴只是靈長類克隆技術研究的第一步，還存在需要進一步研究的問題： ①克隆猴其體細胞來源是流產的胎猴成纖維細胞，如果使用成年猴子的成纖維細胞或者其他類型細胞是否可行？②基因工程技術是否能運用于克隆猴研究，以得到特定疾病猴模型？③相關藥物作用于重組胚胎早期發育，有利于提高囊胚發育率，但是它對胚胎著床后的發育影響還未確定。體細胞克隆猴的成功，標志著我國在克隆技術領域已經處于世界領先水平，將推動我國發展基于非人靈長類疾病動物模型的醫藥研發產業鏈，并促進靈長類全腦圖譜計劃的實施和靈長類腦科學的尖端研究。

伴隨著克隆猴的成功，“克隆人”的話題再度引起人們的關注和熱議。畢竟人與猴在生理結構上高度相似，非人靈長類動物的成功克隆也在一定程度上證明了“克隆人”的理論可行性。由此引發的科技倫理風險也需要我們加以重視，國家層面上要盡快立法規范，構建防范科技惡意使用的法律“防火墻”；學術領域內要建立預警、應急措施和技術儲備，通過建立科技倫理準則，規約高新技術，防止其被濫用、盜用甚至惡用。